Histon Deazetylase-spezifische Modifikation inflammatorischer Mediatoren

Abstract

Einleitung Histon-Deazetylase (HDAC)-Inhibitoren sind für ihre anti- proliferativen und pro-apoptotischen Eigenschaften bekannt. Darüber hinaus sind ihre anti-inflammatorischen Eigenschaften in den Fokus gerückt. Der Einsatz von HDAC-Inhibitoren führt zu einer Verbesserung der experimentellen Kolitis in Mausmodellen, wobei Mechanismen die diese Effekte vermitteln unklar sind. Bekannt ist, dass für Modelle der experimentellen Kolitis T-Zellsubpopulationen entscheidend sind. Um mögliche Mechanismen der HDAC- Inhibitoren in Bezug auf T-Zellen aufzuklären, wurde der Effekt auf die Zytokinfreisetzung untersucht. Da die T-Zellpolarisierung und damit Entstehung inflammatorischer und regulatorischer Subpopulationen eine zentrale Schaltstelle für die mukosale Homöostase darstellt, wurde die Auswirkung des Pan-HDAC-Inhibitors ITF2357 auf die Polarisierung von naiven T-Zellen untersucht. Diesen Gedanken verfolgend wurde der Einfluss des Inhibitors auf den IL-6R untersucht, da IL-6 das entscheidende Zytokin für die Polarisierung pro-inflammatorischer Th17-Zellen darstellt. Um die Relevanz einzelner HDAC auf die anti-inflammatorischen Effekte definieren zu können, wurden diese HDAC durch siRNA-Technologie spezifisch supprimiert, die potentiell für die Vermittlung inflammatorischer Prozesse verantwortlich sind. Methoden Murine CD4+-T-Zellen wurden aus Milzen und Lymphknoten isoliert, mit ITF2357 behandelt und mittels Concanvalin A oder anti-CD3/anti-CD28 stimuliert. Anschließend wurde die IFNɣ-Produktion mittels ELISA analysiert. Ebenso gewonnene naive T-Zellen (CD4+/CD62L+) wurden in An- oder Abwesenheit von ITF2357 unter Th1-polarisierenden Bedingungen stimuliert und nach 48 h die IFNɣ-Konzentration mittels ELISA bestimmt. Die Interleukin-6 Rezeptor (IL-6R) mRNA Expression wurde in unterschiedlich behandelten T-Lymphozyten mittels quantitativer PCR bestimmt. Mittels Chromatinimmunpräzipitation (ChIP) und anschließender quantitativer PCR wurde die Histon 3-Azetylierung am Il6r- Genlocus bei naiven T-Lymphozyten nach Inkubation mit ITF2357 untersucht. Mittels siRNA-Technologie wurden einzelne HDAC spezifisch gehemmt und exemplarisch der Effekt auf die IFNɣ-Produktion auf mRNA-Ebene analysiert. Ergebnisse ITF2357 inhibiert die IFNɣ-Produktion von naiven CD4+-T-Zellen. Für diesen Effekt ist entscheidend, ob mit Concanvalin A oder anti-CD3/anti-CD28 stimuliert wurde. Auch führt die Zugabe des Inhibitors zu naiven CD4+-T-Zellen unter Th1 polarisierenden Bedingungen zu einer Zunahme der IFNɣ produzierenden Zellen. Als eine mechanistische Erklärung für den anti-inflammatorischen Effekt des HDAC-Inhibitors konnte eine Abnahme der IL-6R-Expression auf naiven T-Zellen nach Behandlung mit ITF2357 gezeigt werden. Der IL 6/IL-6R-Signalweg ist für die Polarisierung von Th17 Zellen entscheidend. Unter Einsatz der siRNA-Technologie konnten die HDAC 5, 7 sowie 9 als kritische HDAC für die Vermittlung inflammatorischer Prozesse identifiziert werden. Schlussfolgerungen Die hier vorliegende Arbeit konnte den anti- inflammatorischen Effekt von ITF2357 auf CD4+-T-Zellen zeigen. Entscheidend für die Vermittlung dieses Effektes ist die Wirkung des Inhibitors auf den IL-6/IL-6R-Signalweg der naiven T-Zellen und somit auf die Polarisierung von Th17-Zellen. Die HDAC 5, 7 und 9 konnten als mögliche therapeutische Zielstrukturen identifiziert werden.

Introduction Histone deacetylase (HDAC) inhibitors have been known for their pro-apoptotic and anti-proliferative capacities. Recent studies also described anti-inflammatoriy effects in vitro and in vivo. The present study investigated the effect of the HDAC inhibitor ITF2357 on cytokine release of naive CD4+-T-cells. Additionally the effect of ITF2357 on T cell polarization towards Th1-cells was studied. To furthermore investigate the mechanisms behind the anti-inflammatory potency of HDAC inhibitors, the effect on the interleukin-6 receptor (IL-6R) mRNA expression of naϊve CD4+ T cells was evaluated. IL 6 is one of the key cytokines mediating the polarization of the pro-inflammatory T helper 17 (Th17) cells that are known for their ability in maintaining inflammation and autoimmune diseases. In the second part the aim was to define the specific impact of single HDAC in mediating these anti- inflammatory effects. Methods After isolation from spleens and lymph nodes, murine CD4+ T cells were treated with the HDAC inhibitor ITF2357. The interferon-ɣ (IFNɣ) release was determined by ELISA. In addition, the expression of the IL 6R mRNA in CD4+ T cells in the presence or absence of the pan-HDAC inhibitor ITF2357 was evaluated via quantitative PCR. In order to assess histone 3 acetylation at the site of the Il6r locus in naïve T cells, chromatin immunoprecipitation (ChIP) was performed. siRNA technology served to inhibit specific HDAC and IFNɣ-production was analyzed on the mRNA level as readout. Results The HDAC inhibitor ITF2357 showed an anti-inflammatory effect on naϊve CD4+ T cells. Here the mode of stimulation either with Concanvalin A or anti-CD3/ -CD28 played a critical role with regard to the effect of the inhibitor. Adding the inhibitor to CD4+ T cells under Th1 polarizing conditions leads to an increase of IFNɣ-producing cells. In the presence of ITF2357 a decrease of the IL-6R mRNA expression on naϊve CD4+ T cells was observed, serving as a possible mechanistic explanation for the anti- inflammatory effects, since the IL 6/IL-6R pathway is crucial for polarizing Th17 cells. By applying siRNA technology, HDAC5, 7 and 9 were identified as key HDAC in mediating the anti-inflammatory effects. Conclusion The present study was able to demonstrate an anti-inflammatory effect of HDAC inhibitors on naϊve CD4+ T cells. Down-regulation of the IL 6R mRNA expression could be revealed as one potential mechanism in naïve CD4+ T cells. Furthermore, HDAC5, 7 and 9 were identified as key HDAC in mediating the observed effects and hence might serve as target structures for future therapeutic approached.