Identification of the DEAD-box protein DDX24 as a novel modulator of Huntingtin induced caspase activation

Abstract

Huntington’s disease (HD) is an inherited progressive neurodegenerative disorder which manifests in progressive chorea, dementia and personality changes. The symptoms result from dysfunction and selective loss of neuronal cells in the striatal regions of the brain, caused by an expansion mutation in a polyglutamine sequence in the N-terminus of huntingtin protein (Htt). Proteolytical cleavage of Htt leads to accumulation of the N-terminal Htt fragments. These form cytoplasmatic and intranuclear inclusions which cause cellular dysfunction, cytotoxicity and eventually cell death. The mechanisms in which mutant Htt activates death signaling are still unclear, but key players of the extrinsic and intrinsic apoptosis pathways such as caspases-3/7, -8 and -9 have been found to be overexpressed and/or activated in the presence of mutant Htt. This study was performed to further elucidate the mechanism by which Htt induces cytotoxicity and apoptosis and to investigate proteins which modulate this mechanism. In a Neuro2a cell system I performed an RNAi screen to identify proteins that modulate cytotoxicity of a transiently expressed N-terminal Htt fragment (HD320_Q68). 200 proteins were tested, selected based on literature information about biological processes that might influence HD pathogenesis. The screen revealed 13 highly reproducible modulators from which 7 were classified as toxicity suppressors and 6 as toxicity enhancers. A novel modulator of Htt-induced toxicity identified in this study is DDX24, a member of the DEAD-box protein family presumed to be an RNA helicase. RNAi experiments targeting DDX24 in a HD PC12 cell model demonstrated that DDX24 acts as a toxicity suppressor on Htt- induced caspase-3/7, -8 and -9 activity. Its silencing dramatically enhanced activity of the caspases in presence of mutant Htt (Htt103Q-EGFP). This effect could be rescued by overexpression of the human DDX24 protein. In addition, mRNA levels of DDX24 were upregulated in PC12 cells expressing Htt103Q-EGFP. In control cells expressing a wild-type like Htt25Q-EGFP protein no increase in DDX24 mRNA levels was observed. A similar result was obtained when mRNA levels in striatal tissue of a HD mouse were compared to the wild-type controls; in contrast, DDX24 protein levels were reduced in HD mice. Moreover, I could show that DDX24 does not impact caspase activity by exerting influence on Htt expression or aggregation, nor on the degradation of the mutant protein. Rather, an interaction of DDX24 with FADD, a key component of death receptor-mediated apoptosis signaling could be demonstrated. Additionally, I could show that DDX24 knock-down and FADD overexpression synergistically increase Htt-induced caspase-8 and -3 activity. These findings suggest a protective role of DDX24 in Htt-induced cytotoxicity by modulating death receptor-mediated caspase-8 activation through its interaction with FADD.

Chorea Huntington (HD) ist eine erbliche neurodegenerative Erkrankung, charakterisiert durch fortschreitende Chorea, Demenz und Persönlichkeitsveränderungen. Die Symptome werden durch einen selektiven Verlust an Neuronen im Striatum hervorgerufen, ausgelöst durch eine abnormale Verlängerung in der Polyglutaminsequenz des Huntingtin (Htt) Proteins. Durch proteolytische Spaltung von Htt entstehen N-terminale Proteinfragmente, die im Zytoplasma und im Nucleus akkumulieren und Einschlusskörper bilden, welche zu zellulärer Dysfunktion, Zytotoxizität und Zelltod führen. Es wurde jedoch gezeigt, dass Schlüsselproteine aus verschiedenen Apoptose Signalwegen, wie beispielsweise die Caspasen-3/7, -8 und -9, in Anwesenheit von mutiertem Htt verstärkt exprimiert und/oder aktiviert werden. In einem Neuro2a Zellmodell wurde ein RNAi Screen durchgeführt um Proteine zu identifizieren, die die Zytotoxizität eines transient exprimierten N-terminalen Htt Proteins (HD320_Q68) modulieren. Getestet wurden 200 Proteine, selektiert anhand von Literaturinformationen über biologische Prozesse, die an der HD Pathogenese beteiligt sind. Im Rahmen des Screens wurden 13 gut reproduzierbare Toxizitätsmodulatoren identifiziert, von denen 7 als Toxizitätsunterdrücker und 6 als Toxizitätsverstärker klassifiziert wurden. Ein neu identifizierter Modulator der Htt-induzierten Toxizität ist DDX24, ein Mitglied der DEAD-box Proteinfamilie, für das eine Funktion als RNA Helikase vermutet wird. RNAi Experimente, durchgeführt in einem HD PC12 Zellmodell zeigten, dass DDX24 toxizitätsunterdrückend wirkt. Die Reduktion der DDX24 Expression durch RNAi führte zu einer drastischen Erhöhung der durch mutiertes Htt (Htt103Q-EGFP) hervorgerufenen Aktivität von Capase-3, -8 und -9. Dieser Effekt konnte durch die zeitgleiche Überexpression des humanen DDX24 ausgeglichen werden. Darüber hinaus wurden erhöhte Mengen an DDX24 mRNA in PC12 Zellen gefunden, die toxisches Htt103Q-EGFP Protein exprimierten. In Zellen, in denen das dem Wildtyp (Wt) entsprechende Htt25Q-EGFP Protein exprimiert wurde, war hingegen keine Erhöhung der mRNA Menge festzustellen. Eine vergleichbare Erhöhung der DDX24 mRNA wurde beim Vergleich im Striatum von HD Mäusen gegenüber dem Wildtyp detektiert. Im Gegensatz zur mRNA von DDX24 waren die DDX24 Proteinmengen in den HD Mäusen gegenüber dem Wildtyp allerdings verringert. Es wurde außerdem gezeigt, dass der Einfluss von DDX24 auf die Caspaseaktivität nicht mit einer Modulierung der Expression, der Aggregation oder dem Proteinabbau von mutiertem Htt in Verbindung steht. Stattdessen konnte eine Interaktion von DDX24 mit FADD, einer Schlüsselkomponente des extrinsischen Apoptosesignalweges nachgewiesen werden. Eine Reduktion von DDX24 durch RNAi und die gleichzeitige Überexpression von FADD fürhten zu einer synergistischen Erhöhung der Caspase-8 und -3 Aktivität. Anhand dieser Ergebnisse wird angenommen, dass DDX24 durch seine Interaktion mit FADD die rezeptorvermittelte Caspase-8 Aktivität moduliert und damit protektiv auf die Htt-induzierte Zytotoxizität wirkt.