Relevance of 2,4 dienoyl-CoA-reductase of Leishmania mexicana and L. major for virulence

Abstract

Two proteome studies of the parasite Leishmania mexicana were performed. The first study compared proteomes of amastigotes, purified from their intracellular habitat, to promastigotes, the extracellular life cycle form. Identification of proteins secreted by amastigotes was the focus of the second study. More than 1800 leishmanial proteins were identified, of which more than 740 were not previously reported, and contributed to the current 2500 detected proteins for that genus. That equals approximately 30% of the proteome predicted based on genome data. Moreover 143 potentially secreted proteins were identified. Bioinformatic analyses of genes corresponding to protein datasets revealed clear evidence for translational bias in codon usage in Leishmania. Comparison of the promastigotes and amastigote proteomes led to the identification of upregulated proteins in amastigotes. Analysis of the respective loci identified characteristic sequence motifs in the 3’untranslated regions, which may represent, or be linked to, translational control elements. A subset of proteins upregulated in amastigotes was involved in the catabolism of fatty acids. This led to the hypothesis that proteins of this subset may be virulence factors. A candidate, 2,4 dienoyl-CoA-reductase (DECR), was chosen for further investigation. The leishmanial DECR is related to an equivalent bacterial protein but has no homology to equivalent higher eukaryotic DECR enzymes. For the analysis of its contribution to virulence and pathogenicity, decr deficient parasites were generated. Infection of BALB/c mice, which are susceptible to Leismania spp., revealed that compared to wild type parasites, those devoid of decr were less virulent. It was further hypothesised, that the parasites sequester fatty acids for their own energy metabolism and this alters the lipid homeostasis of the host cell. Cells control their lipid homeostasis by transcription factors. Quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction of target genes of those transcription factors revealed that the genes involved in cholesterol biosynthesis were upregulated in infected macrophages. Further analysis revealed that cholesterol is retained in parasite harbouring compartments. In summary, a novel virulence factor in Leishmania was identified, which could be an appropriate target for the development of novel anti-parasitic drugs. In addition Leishmania alters the lipid homeostasis of the macrophage which could be linked to immuno-modulation.

Bestandteil dieser Arbeit waren zwei Proteomanalysen des Parasiten Leishmania mexicana. In der ersten wurde das Proteom von aus ihrem intrazellulären Habitat aufgereinigten Amastigoten, mit dem Proteom von Promastigoten, der extrazellulären Lebensform, verglichen. Der Fokus der zweiten Proteomanalyse war die Identifizierung von bei Amatigoten sezernierten Proteinen. Insgesamt wurden mehr als 1800 Proteine identifiziert, von denen mehr als 740 zuvor noch nicht detektiert worden waren. Diese Analysen tragen großen Anteil an den nun insgesamt 2500 ermittelten Proteinen, was ungefähr 30%, des auf dem Genom- basierenden vorhergesagten Proteomes entspricht. Außerdem konnten 143 potentiell sezernierte Proteine ermittelt werden. Bioinformatische Analayse, der den identifizierten Proteine entsprechenden Gene, machte einen klaren translationalen Bias im Codongebrauch bei Leishmanien deutlich. Der Vergleich des Proteomes von Promastigoten und Amastigoten detektierte im letzteren Lebensstadium hochregulierte Proteine. Analyse der entsprechenden Genloci identifizierte charakteristische Sequenzmotive in den 3’-untranslatierten Regionen, diese stellen möglicherweise auf Translationsebene wirkende regulatorische Elemente dar. Eine Untergruppe, der in Amastigoten hochregulierten Proteine, waren Enzyme des katabolen Fettsäurestoffwechsels. Daraus wurde die Hypothese abgeleitet, dass Proteine dieser Untergruppe Virulenzfaktoren sein könnten. Die 2,4 Dienoyl-CoA Reduktase (DECR), wurde für weitere Untersuchungen ausgewählt, da sie zwar homolog zu einen äquivalenten bakteriellen Protein ist, aber keine Homologie zu äquivalenten Proteinen höherer Eukaryoten aufweist. Um zu analysieren, ob DECR zur Virulenz und Pathogenität beiträgt, wurden Parasiten hergestellt, die kein decr Gen mehr besitzen. Durch Infektion von BALB/c Mäusen, welche anfällig gegenüber Leishmanien sind, konnte gezeigt werden, dass Parasiten, denen decr fehlte, eine verminderte Virulenz gegenüber dem Wildtyp aufwiesen. Eine weitere Hypothese war, dass Parasiten zur Deckung ihres eigenen Energie-Metabolismus der Wirtszelle Fettsäuren entziehen, und dies die Lipid-Homeostase der Wirtszelle beeinflusst. Zellen kontrollieren ihre Lipid- Homeostase mit Hilfe von Transkriptionsfaktoren. Die Quantifizierung der Genexpression der durch diese Transkriptionsfaktoren regulierten Gene, machte deutlich, dass Gene deren Proteine in der Biosynthese von Cholesterol beteiligt sind, in infizierten Makrophagen höher exprimiet waren. Durch biochemische Methoden konnte gezeigt werden, dass im Parasitenenthaltendem Kompartiment der Wirtszelle, Cholesterol zurückbehalten wird. Zusammenfassend wurde ein neuer Virulenzfaktor in Leishmanien identifiziert, welcher ein Kandidat für die Entwicklung eines neuen anti-parasitären Medikaments sein könnte. Außerdem wurde gezeigt, dass Leishmanien die Lipid-Homeostase von Makrophagen verändern, was Einfluss auf die gesamte Immunantwort nehmen könnte.