Therapeutischer Nutzen der Anwendung einer CpG-ODN/GNP-Inhalationslösung zur Behandlung der COB-Erkrankung des Pferdes: Eine klinische Feldstudie, einschließlich der Erhebung allgemeiner statistischer Daten zur COB-Erkrankung in Deutschland anhand eines Fragenbogens

Abstract

Die chronisch obstruktive Bronchitis (COB) ist die in der nördlichen Hemisphäre am häufigsten auftretende Atemwegserkrankung des Pferdes. Sie beruht auf dem Zusammenspiel bestimmter genetischer und umweltassoziierter Faktoren und tritt daher auch bei betroffenen Pferden nur nach Allergenkontakt auf. In Bezug auf ihre Pathologie ist die COB-Erkrankung des Pferdes daher mit der humanen Asthmaerkrankung vergleichbar. Die COB führt in hochgradigen Fällen zu einem enormen Leidensdruck bei den betroffenen Patienten und stellt auch für die Pferdebesitzer eine außerordentlich große emotionale sowie finanzielle Belastung dar. Der weiteren Erforschung der Ätiologie, Pathologie und langfristiger Therapiemöglichkeiten dieser Erkrankung sollte daher oberste Priorität eingeräumt werden. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, zum einen unter Zuhilfenahme einer Fragebogenhomepage allgemeine Daten zur COB- Erkrankung in Deutschland zu erheben und Patienten für die im Anschluss durchgeführte, klinische Feldstudie zu akquirieren. Zum anderen wurde in einer doppelt verblindeten, prospektiv randomisierten und placebokontrollierten Feldstudie die Wirksamkeit und Verträglichkeit einer inhalativen Verabreichung von Cytosin-Phosphat-Guanin- Oligodeoxynukleotiden (CpG-ODN), gebunden an ein nanopartikuläres Trägersystem als ein neues Therapieverfahren zu Behandlung der COB-Erkrankung des Pferdes überprüft. Die Fragebogenhomepage wurde in Kooperation mit der Rechnerbetriebsgruppe der LMU München unter Verwendung des LimeSurvey®-Programmes erstellt. Mit Hilfe der Homepage wurden Daten über das erstmalige Auftreten der COB-Erkrankung, über unterschiedliche Verlaufsformen, über eine etwaige Symptomvarianz, über die Entwickelung der Leistungsfähigkeit des jeweiligen Patienten, über den An- und Verkauf COB-kranker Pferde und über die Art der durchgeführten Diagnosestellung und Therapie seitens der behandelnden Tierärzte erhoben. Insgesamt konnten 266 vollständig ausgefüllte Fragebögen ausgewertet werden. Die Analyse der Fragebögen zeigte, dass das Durchschnittsalter für das erstmalige Auftreten der COB-Erkrankung in Deutschland 10,10 Jahre (SE = 0,297) betrug und in 70% der Fälle Krankheitsexazerbationen auftraten, bei denen die Krankheitssymptome über rund acht Wochen bestehen blieben. Der Kontakt zu trockenem Heu wurde in über der Hälfte der Fälle (52,3%) als Auslöser für eine Krankheitsexazerbation ermittelt. Der anhand des Umfrageergebnisses errechnete zeitliche Abstand zwischen zwei Krankheitsexazerbationen betrug im Durchschnitt acht Monate. Anhand der eigenen Untersuchungen konnte belegt werden, dass sowohl die Anzahl als auch das Ausmaß der auftretenden Krankheitssymptome im Laufe der Erkrankung deutlich zunahmen. Den größten Zuwachs im Rahmen von Exazerbationen der COB-Erkrankung erfuhren hierbei die Krankheitssymptome „verstärkt abdominale Atmung“ (Anstieg um 16,5%), „verminderte Leistungsfähigkeit“ (Anstieg um 12,8%) und „Husten zu Beginn der Belastung“ (Anstieg um 10,5%). In über der Hälfte der Fälle (65%) nahm die Leistungsfähigkeit der Pferde laut Angaben der Besitzer deutlich ab. Sofern es nach dem Auftreten der COB- Erkrankung überhaupt noch zu einer Teilnahme an reitsportlichen Wettbewerben kam, wurde eine Abnahme der erzielten Turniererfolge um rund zehn Prozent festgestellt. Als durchschnittliche jährliche Mehrkosten für die Pferdebesitzer aufgrund der COB-Erkrankung ihres Pferdes wurde ein Betrag von 856 € (SE = 65,9) ermittelt. Vermutlich führten all die festgestellten negativen Faktoren in ihrer Gesamtheit dazu, dass in 71,4% der Fälle ein erneuter Erwerb eines COBkranken Pferdes von den Pferdebesitzern kategorisch abgelehnt wurde. Die Ergebnisse der Umfrage zeigten einerseits, dass das gewählte Medium von den Pferdebesitzern gut angenommen wurde und sich mit Hilfe einer Fragebogenhomepage sehr leicht studienbegleitend Daten zu tiermedizinischen Fragestellungen erheben ließen. Die Erstellung einer Homepage, anhand derer sich der Erfolg eines Therapieverfahrens belegen lässt oder die zur Diagnosestellung von Krankheiten dient, könnte eine sinnvolle Weiterentwicklung der in dieser Arbeit verwendeten Fragebogenhomepage darstellen. Zusammenfassend lässt sich als Ergebnis der eigenen Umfrage festhalten, dass es sich bei der COB-Erkrankung des Pferdes in Deutschland um eine chronischprogressive Erkrankung handelt, bei welcher im Rahmen von Exazerbationen über einen Zeitraum von zwei Monaten Krankheitssymptome in zum Teil höchstgradiger Ausprägung bei den betroffenen Patienten bestehen bleiben. Der Erforschung von Therapiemöglichkeiten, die eine langfristige Besserung dieser Symptome bei COB-kranken Pferden bewirken, sollte daher oberste Priorität eingeräumt werden. Die im Rahmen des zweiten Teils dieser Arbeit verwendete CpG-ODNInhalationslösung stellt einen neuen und vielversprechenden therapeutischen Ansatz mit möglicherweise langfristiger Wirkung zur Behandlung der COBErkrankung des Pferdes dar. Durch die Verwendung der CpG-ODN/GNP Inhalationslösung sollte ein immunmodulatorischer Effekt („Th1-Shift“) bei den Patienten im Feldversuch induziert werden. Dieser Effekt wurde bereits in vorangegangenen in vitro und tierexperimentellen in vivo Studien nachgewiesen. Da die Wirkung von CpG-ODN auf große Säugetiere weniger stark ausgeprägt ist (als vergleichsweise bei Nagetieren), wurden Gelantinenanopartikel (GNP) als Transportsystem für die CpG-ODN verwendet. Diese schützten die CpG-ODN vor einem vorzeitigen Abbau durch körpereigene Nukleasen und führten zu einer Wirkungsverstärkung in den Zielzellen. In die klinische Feldstudie wurden insgesamt 24 Pferde aufgenommen, deren Besitzer sich über die Fragebogenhomepage um eine Aufnahme ihres Pferdes in die Studie beworben hatten oder die von ihren Haustierärzten überwiesen worden waren. Bei jedem der Patienten wurde zunächst anhand eines etablierten Scoringsystems der momentane Schweregrad der Erkrankung („gering - mittelgradig“ bzw. „hochgradig“) ermittelt. Unter Berücksichtigung des zuvor erhoben „Krankheitsscores“ erfolgte eine Zuteilung zur Verum- oder Placebogruppe per Losverfahren. Die Placebogruppe bestand aus jeweils vier gering-mittelgradig und vier hochgradig erkrankten Patienten, die Verumgruppe aus jeweils acht gering-mittelgradig und acht hochgradig erkrankten Patienten. Die Patienten beider Gruppen wurden fünfmal (im Abstand von jeweils zwei Tagen) inhaliert, wobei die Patienten der Verumgruppe die CpG-ODN/GNPInhalationslösung (0,18mg CpG-ODN gebunden an 3,75mg GNP, gelöst in 2,5ml hochgereinigtem Wasser) verabreicht bekamen. Die Patienten der Placebogruppe wurden nur mit hochgereinigtem Wasser und GNP inhaliert, wobei der Anteil der CpG-ODN in der Inhalationslösung vollständig durch hochgereinigtes Wasser ersetzt wurde. Nach Abschluss der Inhalationstherapie wurde eine erste und zweite Nachuntersuchung (jeweils einen Tag nach der letzten Inhalationsbehandlung und nach vier Wochen) durchgeführt, um mögliche Therapieerfolge sowohl direkt im Anschluss an die Behandlung als auch mit größerem zeitlichem Abstand nachweisen zu können. Ziel der praktischen Studie war es, die positive Wirkung der verwendeten Inhalationslösung anhand unterschiedlicher klinischer Parameter (Ruheatemfrequenz, Atemtyp, Nasenausfluss, Befunde der Lungenauskultation, arterielle Blutgasanalytik, Interpleuraldruckmessung) sowie anhand endoskopisch bestimmbarer Parameter (Sekretmenge, Sekretviskosität, Beurteilung der Bifurcatio tracheae) und anhand einer zytologischen Untersuchung des Tracheobronchialsekrets nachzuweisen. Bei keinem der Patienten konnten während oder nach der Inhalationstherapie lokale oder systemische Unverträglichkeiten festgestellt werden, was für die gute Verträglichkeit der verwendeten Dosis und des verwendeten Inhalationsprotokolls sprach. Innerhalb der beiden Placebogruppen (gering- mittelgradig und hochgradig erkrankte Patienten) konnten für keinen der untersuchten Parameter signifikante Verbesserungen aufgezeigt werden. Darüber hinaus belegten die Ergebnisse innerhalb der Placebogruppen jedoch, dass auch die alleinige inhalative Anwendung von GNP beim Pferd gut verträglich war. In beiden Verumgruppen kam es hingegen nach fünfmaliger Inhalation mit der CpG- ODN/GNP-Inhalationslösung zu einer signifikanten Verbesserung der Atemfrequenz und des Sauerstoffpartialdruckes. Die durchschnittliche endoskopisch ermittelte Menge an Tracheobronchialsekret nahm in der Gruppe der gering- mittelgradig erkrankten Pferde nach fünf Inhalationen hochsignifikant ab, zusätzlich konnte auch ein signifikanter Langzeiteffekt für diese Reduktion belegt werden. In der Gruppe der hochgradigen COB-Patienten kam es zu einer signifikanten Abnahme der Sekretmenge, die ebenfalls über vier Wochen anhielt. Der gezeigte Atemtyp war bei der ersten Nachuntersuchung in der Verumgruppe der gering-mittelgradig erkrankten Pferde sehr signifikant und in der Verumgruppe der hochgradig erkrankten Patienten hochsignifikant verbessert, und in beiden Verumgruppen ließ sich ein signifikanter Langzeiteffekt dieses Befundes nachweisen. Deutliche Hinweise für das Vorliegen einer hypoxischen Stoffwechsellage stellen sowohl die Erhöhung der Atemfrequenz als auch die Abnahme des arteriell gemessenen Sauerstoffpartialdruckes dar. Die synchrone Verbesserung beider Untersuchungsparameter zeigte folglich, dass sich die bei COB-Patienten vorliegende Störung des pulmonalen Gasaustausches durch nur fünfmalige Inhalation mit der CpG-ODN/GNP-Inhalationslösung signifikant verbesserte. Es ist darüber hinaus davon auszugehen, dass durch die Reduktion der Sekretmenge in den Atemwegen die für die Patienten oft quälende Hustensymptomatik deutlich und langfristig gemindert werden konnte. Der zu Therapiebeginn festgestellte, unphysiologische Atemtyp war Zeichen einer erhöhten maximalen Interpleuraldruckdifferenz (ΔPplmax), die auf die bei COBPatienten immer vorliegende Bronchokonstriktion zurückzuführen war. Die Verbesserung des von den Patienten gezeigten Atemtypes war demnach auch als Hinweis für eine Abnahme der vorliegenden Bronchokonstriktion zu werten. Somit konnte durch nur fünfmalige Verwendung der CpG-ODN/GNPInhalationslösung einer der drei hauptsächlichen Pathomechanismen der COBErkrankung höchst erfolgreich und mit Ausprägung eines Langzeiteffektes therapiert werden. Entsprechende Langzeiteffekte sind (nach Kenntnisstand der Autorin) bisher ohne eine gleichzeitige Verbesserung der Haltungsbedingungen mit keinem anderen Therapieverfahren erzielt worden. Abschließend ist daher festzuhalten, dass die vorliegende Studie den Nachweis für die Durchführbarkeit einer Inhalationstherapie mit CpG-ODN/GNPInhalationslösungen unter Feldbedingungen und deren gute therapeutische Wirksamkeit erbringt. Besonders ist hierbei hervorzuheben, dass mit dem durchgeführten Therapieprotokoll ein positiver Langzeiteffekt bei sieben der zehn untersuchten Parameter (Atemtyp, Nasenausfluss, Auskultationsbefund, Sekretmenge, Sekretviskosität, Aussehen der Bifurcatio tracheae und Anzahl der neutrophilen Granulozyten an der Gesamtzellzahl des TBS bei hochgradig erkrankten Patienten) erzielt werden konnte. Daher sollte der immunologische Mechanismus („Th1-Shift“), auf dem die therapeutische Wirkung der verwendeten Inhalationslösung beruht, in zukünftigen Studien noch genauer erforscht werden, um eine Verstärkung oder Verlängerung der therapeutischen Effekte forcieren zu können. Die Anwendung einer CpG-ODN/GNP-Inhalationslösung in Kombination mit der spezifischen Immuntherapie (SIT) könnte zu einer weiteren Verstärkung der positiven Wirkungen führen und sollte daher in zukünftigen Arbeiten untersucht werden.

Recurrent airway obstruction (RAO) is the most frequently occurring respiratory disease of horses in the northern hemisphere. It is based on the interaction of certain genetic and environment-associated factors and, therefore, occurs in affected horses only after contact with allergens. As for its pathology, RAO of the horse is comparable to asthma in humans. In serious cases, RAO leads to an enormous psychological strain for the affected patients and also constitutes an extraordinarily great emotional and financial burden for the horse owners. Thus, highest priority should be given to the further investigation of etiology, pathology and long-term therapeutic possibilities. The purpose of the present study was, on the one hand, to collect general data about RAO in Germany with the aid of a questionnaire homepage and to acquire patients for the clinical field study performed subsequently. On the other hand, the effectiveness and tolerance of an inhalative administration of cytosine-phosphateguanine- oligodeoxynucleotides (CpG-ODN), bonded to a nanoparticle carrier system (Gelantin Nanoparticels, GNP), was tested in a double-blinded, prospectively randomized and placebo-controlled field study as a new therapeutic procedure for treatment of RAO in the horse. The questionnaire homepage was developed in cooperation with the computer operation group of the LMU Munich using the LimeSurvey® program. With help of the homepage, data was collected regarding the first occurrence of RAO, various courses of the disease, possible variation of symptoms, the development of each patient’s performance, the purchase and sale of RAO -affected horses, and the type of diagnosis and therapy carried out by the treating veterinarians. In total, 266 completely filled out questionnaires could be evaluated. Analysis of the questionnaires showed that the mean age for first occurrence of RAO in Germany was 10.10 years (SE = 0.297), and that exacerbation of the disease occurred in 70% of cases. In these cases, the symptoms of the disease continued for about eight weeks. The contact to dry hay was determined to be the trigger for exacerbation of the disease in over half of all cases (52.3%). The temporal interval between two exacerbations, calculated on the basis of the survey’s result, averaged 8 months. By means of our own analysis, it could be proven that the number as well as the extent of the occurring symptoms of the disease clearly increased over the course of the disease. The symptoms “enforced abdominal breathing” (increase by 16.5%), “reduced performance” (increase by 12.8%) and “coughing at beginning of riding” (increase by 10.5%) showed the greatest increase in the context of exacerbations of RAO. In over half of the cases (65%), the horses’ performance clearly decreased according to information from the owners. Provided that a participation in horse shows took place at all after the occurrence of RAO, a decrease of achieved success of about ten percent was observed. An amount of 856 € (SE = 65,9) was calculated as average annual additional costs for the horse owners as a result of their horse’s RAO. Presumably, all of these ascertained negative factors as a whole led to the result that in 71.4% of cases a new purchase of a RAO-affected horse was categorically rejected by the horse owners. The results of the questionnaire showed that the chosen medium was accepted well by the horse owners and that, by using a questionnaire homepage, it was very easy to collect study-related data regarding veterinarian questions. The creation of a homepage with which the success of a therapeutic method can be proven or which helps for diagnosis of diseases could represent a meaningful further development of the questionnaire homepage used in this study. In summary, the result of our own survey shows that RAO of the horse in Germany is a chronic progressive disease, in which in case of exacerbations symptoms of the disease in partially severe form remain in the affected patients over a period of two months. The investigation of therapeutic options which result in a long-term improvement of these symptoms in RAO-affected horses should therefore be granted highest priority. The CpG- ODN/GNP inhalation solution, used within the scope of the second part of this study, represents a new and promising therapeutic approach with possible long- term effect for treatment of RAO in horses. By use of the CpG-ODN/GNP inhalation solution, an immunomodulatory effect (“Th1-Shift”) was supposed to be induced in the patients in the field study. This effect had already been proven in previous in-vitro and animal-experimental in-vivo studies. Since the effect of CpG-ODN is less pronounced in large mammals (than as, e.g., in rodents), gelatin nanoparticles were used as carrier system for the CpG-ODN. These protected the CpG-ODN against a premature decomposition through the body’s nucleases and led to an enhancement of the effect in the target cells. A total of 24 horses were admitted to the clinical field study, whose owners had applied for acceptance of their horse to the study through the questionnaire homepage or who were referred by their general veterinarian practitioners. In each patient the current severity of the disease (“mild- moderate” or “severe”) was initially determined on the basis of an established scoring system. In consideration of the previously determined “disease score”, an allocation to the verum group or the placebo group was carried out by lot procedure. The placebo group consisted of 4 mildly to moderately affected patients and 4 severely affected patients; likewise, the verum group consisted of 8 mildly to moderately affected patients and 8 severely affected patients. The patients of both groups were inhaled five times (at intervals of two days each), whereas the patients of the verum group were administered the CpGODN/ GNP inhalation solution (0.18mg CpG-ODN bound to 3.75mg GNP, dissolved in 2.5ml highly purified water). The patients of the placebo group were inhaled only with highly purified water and GNP, whereby the share of CpGODN in the inhalation solution was completely replaced by highly purified water. After completion of the inhalation therapy, first and second follow-up examinations were performed (in each case one day after the last inhalation treatment and again after four weeks) to be able to prove possible therapeutic results directly following the treatment as well as after a greater temporal interval. The goal of the practical study was to prove the positive effect of the used inhalation solution based on various clinical parameters (respiratory rate at rest, breathing type, nasal discharge, results of the auscultation of the airways, arterial blood gas analysis, measurement of intrapleural pressure) as well as endoscopically determinable parameters (amount of secretion, viscosity of secretion, assessment of the tracheal bifurcation) and a cytological examination of tracheobronchial secretion. No local or systemic intolerance could be detected in any of the patients during or after the inhalation therapy, which speaks for good tolerance of the used dose rate and the used inhalation protocol. Within both placebo groups (mild-moderate and severely affected patients), no significant improvements could be shown for any of the examined parameters. Above all, the results within the placebo groups prove the good tolerance of the solely inhalative application of GNP in the horse. In both verum groups, however, after five inhalations with the CpG-ODN/GNP inhalation solution, a significant improvement of respiratory rate and oxygen partial pressure could be observed. The average endoscopically determined amount of tracheobronchial secretion decreased significantly in the group of mildly to moderately affected horses after five inhalations. Also, a significant long-term effect could be proven for this reduction. In the group of severely affected patients, a significant decrease in the amount of secretion could be observed, that also lasted over a period of four weeks. At the first follow-up examination, the apparent breathing type in the verum group of mildly to moderately affected horses was very significantly improved and in the verum group of severely affected horses highly significantly improved. In both verum groups, a significant long-term effect of this finding could be proven. Clear indications for the existence of a hypoxic metabolic situation are the increased respiratory breathing rate as well as the decrease in the arterially evaluated oxygen partial pressure. Hence, the synchronic improvement of both examined parameters showed that, with only five inhalations with the CpGODN/ GNP inhalation solution, the existing dysfunction of pulmonary gas exchange in RAO patients was significantly improved. In addition, one can assume that, through the reduction of the amount of secretion in the airways, the often excruciating coughing symptoms could be reduced clearly and on a long-term basis. The unphysiological breathing type, detected at the beginning of therapy, was a sign for increased maximum tidal volume difference (ΔPplmax) that is attributed to the bronchoconstriction which always exists in RAO patients. The improvement in the breathing type shown by the patients could, therefore, also be seen as evidence for a decrease of the existing bronchoconstriction. Consequently, one of the three main pathomechanisms of RAO could be treated most successfully and with development of a long-term effect through a mere five-time application of the CpG-ODN/GNP inhalation solution. Equivalent long-term effects have not been achieved to date (to the author’s knowledge) with any other therapeutic method without a simultaneous change in housing conditionF In closing, it should be noted that the present study provides proof of the practicability of inhalation therapy with CpG-ODN/GNP inhalation solutions under field conditions and their therapeutic effectiveness. In particular, it should be emphasized that in the therapeutic protocol carried out here a positive longterm effect could be achieved in seven of the ten examined parameters (breathing type, nasal discharge, results of the auscultation, amount of secretion, viscosity of secretion, appearance of the tracheal bifurcation and the number of neutrophil granulocytes in the total cell count of the tracheobronchial secretion in severelyaffected patients). Therefore, the immunologic mechanism (“Th1-shift”), on which the therapeutic effect of the used inhalation solution is based, should be investigated more precisely in future studies to be able to accelerate an enhancement or extension of the therapeutic effects. The application of a CpG-ODN/GNP inhalation solution in combination with the specific immunotherapy (SIT) could lead to a further enhancement of the positive effects and should be investigated in future studies.