High throughput approaches to studying virology: applications to the koala retrovirus KoRV and gibbon ape leukemia virus GALV

Abstract

Retroviruses are widely studied since they are important pathogens of vertebrates, they have the tendency to infect new species, with the associated risk of causing pathologies in the new hosts and they are valuable biomedical tools applied in gene transfer and gene therapy. Furthermore, endogenous retroviruses (ERVs) have colonized the genome of most vertebrate species, with retroviral endogenization having played a key role in the evolution of vertebrate genomes. The koala retrovirus (KoRV) is the only known retrovirus which is currently in the process of invading the germ line of its host species. KoRV is also believed to induce leukemia, lymphomas and immunosuppression in koalas, which may eventually cause higher susceptibility to the highly prevalent Chlamydia infection in this species. The first aim of this thesis was to evaluate the effect of KoRV on koala health through the study of koala microbial communities (microbiomes). In Chapter II, I characterized by 16S ribosomal RNA amplicon high-throughput sequencing the ocular, oral, rectal and fecal microbiomes of two healthy captive koalas. This study established the healthy baseline for koala microbiomes to which microbiomes of diseased states can be compared. I also analysed the digestion- associated bacterial communities to determine whether such communities may be unusual in koalas, given their special diet based almost exclusively on Eucalyptus leaves. This study demonstrated that koala microbiomes were generally similar in composition to the microbiomes from the same body regions of other mammals. Another particular aspect of KoRV is its closest relationship to the gibbon ape leukemia virus (GALV), a retrovirus which infects gibbons in Southeast Asia. KoRV and GALV are supposed to be the results of a cross-species transmission which likely occurred via intermediate as yet unknown hosts. The second aim of this thesis was to investigate the evolutionary history of KoRV and GALV, trying to identify intermediate hosts involved in the cross-species transmission between gibbons and koalas. In Chapter III, I generated the complete genomic sequences of each GALV strain from GALV-infected cell lines. The GALV clade was sister group of the koala retroviruses (KoRVs). Signs of positive selection were detected across the genome of the more pathogenic strains of GALV and KoRV, particularly in the envelope gene, the most exposed portion of the virus to host immune system, suggesting that host immune pressure is shaping the evolution of this retroviral clade. In Chapter IV, a wide range of Southeast Asian rodent species were screened for the presence of KoRV and GALV-like sequences. An ERV very closely related to WMV was found in a newly discovered subspecies of Melomys burtoni from Indonesia. M. burtoni is not present in Southeast Asia, therefore gibbons must have been infected by another host which is still unknown. However, the newly identified virus is the most closely related non- primate retrovirus to GALV isolated to date and the most proximate record of GALV to the Asian continent and to the distribution of gibbons.

Retroviren sind umfassend erforscht, da sie wichtige Pathogene von Wirbeltieren sind. Sie haben die Tendenz neue Arten zu infizieren mit der Gefahr, und sie sind wertvolle biomedizinische Werkzeuge. Außerdem haben endogenen Retroviren (ERVs) das Genom von den meisten Wirbeltierarten kolonisiert, wobei Endogenisierung von Retroviren eine Schlüsselrolle in der Evolution der Genome von Wirbeltieren gespielt hat. Der Koala Retrovirus (KoRV) ist der einzige bekannte Retrovirus, der zurzeit in die Keimzellen seiner Wirte eindringt. Es wird auch vermutet, dass KoRV Leukämie, Lymphome und Immunsuppression in Koalas verursacht, was letztendlich zu einer höheren Anfälligkeit von Koalas gegenüber der weit verbreiteten Infektion mit Chlamydien führen könnte. Das erste Ziel dieser Dissertation war es, die Wirkung von KoRV auf die Gesundheit von Koalas durch die Studie der mikrobiotischen Zusammensetzung (Mikrobiome) zu untersuchen. In Kapitel II habe ich mittels Hochdurchsatzsequenzierung von 16S ribosomaler RNA-Amplikons das Mikrobiom des Auges, des Mundes, des Afters und des Kots von zwei in Gefangenschaft lebenden Koalas charakterisiert. Diese Studie hat den Normalzustand der Mikrobiome in gesunden Koalas etabliert, zu welchen Mikrobiome von kranken Koalas verglichen werden können. Ich habe auch die Bakteriengemeinschaften analysiert, die mit der Verdauung in Verbindung stehen um zu bestimmen, ob hier Auffälligkeiten auf Grund der speziellen Nahrung von Koalas, die fast ausschließlich aus Eukalyptusblättern besteht, zu finden sind. Diese Studie hat demonstriert, dass Koala Mikrobiome in der Zusammensetzung den Mikrobiomen der gleichen Körperstellen anderer Säugetiere allgemein ähnlich waren. Eine andere Besonderheit von KoRV ist seine sehr nahe Verwandtschaft zum Leukämievirus des Gibbons (GALV), ein Retrovirus, der Gibbons in Südostasien befällt. KoRV und GALV sind vermutlich das Ergebnis einer Übertragung über die Artengrenzen hinweg, die wahrscheinlich über einen bisher unbekannten Zwischenwirt stattgefunden hat. Das zweite Ziel dieser Dissertation war es, die Entwicklungsgeschichte von KoRV und GALV zu untersuchen, und den Zwischenwirt zu identifizieren, der an der artübergreifenden Übertragung zwischen Gibbon und Koala beteiligt war. Im Kapitel III habe ich die gesamte genomische Sequenz aller GALV-Stämme aus GALV-infizierten Zelllinien rekonstruiert. Die GALV Klade war eine Schwestergruppe der Koala Retroviren (KoRVs). Hinweise auf positive Selektion wurden überall im Genom der pathogeneren Stämme der GALV und KoRV gefunden, vor allem in dem Gen, das die Virushülle kodiert, welches dem Immunsystem am meisten exponiert ist. Dies weist darauf hin, dass der Selektionsdruck vom Immunsystem des Wirtes ausgeht und so die Evolution der Retrovirenklade geprägt hat. Im Kapitel IV wurde ein groß angelegtes Screening von südostasiatischen Nagetierarten auf KoRV und GALV ähnliche Sequenzen durchgeführt. Ein ERV, der sehr eng mit WMV verwandt ist, wurde in einer neulich entdeckten Unterart von Melomys burtoni in Indonesien entdeckt. M. Burtoni kommt nicht in Südostasien vor, weswegen Gibbons durch einen anderen Wirt infiziert worden sein müssen, der bisher noch unbekannt ist. Dennoch ist der neu identifizierte Virus der mit GALV am nächsten verwandte Nicht-Primaten Retrovirus, der bisher isoliert wurde. Auch ist er der GALV, der am nächsten zum asiatischen Kontinent und der Verbreitung von Gibbons entdeckt wurde.