Innovative Ansätze in der Diagnostik und Therapie gastrointestinaler Tumore: Apoptose- und Zellzyklus-regulierende Proteine und ihre Bedeutung

Abstract

Patienten mit gastrointestinalen Tumoren haben eine unterschiedlich gute Prognose, die trotz intensiver wissenschaftlicher Bemühungen noch immer am meisten von dem TNM-Stadium bei Diagnosestellung abhängt. Etablierte Prognose- Biomarker, die routinemäßig einsetzbar sind, um eine Aussage über das zu erwartende biologische Verhalten des Tumors zu treffen, gibt es bislang nicht. Ich habe in meinen Arbeiten nach neuen Zielstrukturen sowohl für die Diagnostik als auch für die Therapie gastrointestinaler Tumore gesucht. Anhand von einem definierten Patientenkollektiv kolorektaler Karzinome konnte ich verschiedene neue Proteine als vielversprechende prognostische Marker identifizieren: Peripherer Benzodiazepinrezeptor (PBR), die neuroendokrine Differenzierung, eine erhöhte Sialyl-LeX-Expression, Mutationen im p53-Gen und eine verminderte Bax-Expression. Ich konnte nachweisen, dass Patienten mit neuroendokrin differenzierten kolorektalen Karzinomen (ca. 40%) eine signifikant schlechtere Prognose haben als die Patienten mit nicht neuroendokrin differenzierten Adenokarzinomen des Kolon und Rektums. Erstmals konnte ich zeigen, dass ein alterierter p53/Bax-Signaltransduktionsweg mit einem signifikant schlechteren klinischen Verlauf im Stadium UICC III kolorektaler Karzinome korreliert. Im Fall des Sialyl-LeX, dessen Expression mit Tumorzellextravasation und Metastasierung in Verbindung gebracht wird, kommt es bereits im frühen Tumorstadium UICC II zu einer Hochregulierung und Expression. Hier bietet sich ein neuer Ansatz zur Stratefizierung, welche Patienten in diesem frühen Stadium von einer zusätzlichen Therapie profitieren könnten. Neben der Analyse einzelner prognostischer Marker konnte ich in dieser Arbeit aber auch zeigen, dass eine Kombination verschiedener prognostischer Marker, die verschiedene genetische Ereignisse repräsentieren und unabhängig voneinander sind, eine deutlich bessere prognostische Aussagefähigkeit besitzen als nur ein Marker alleine. Hier wurde die sogenannte multifaktorielle Diskriminanzanalyse angewendet. Dadurch ist es möglich, Subgruppen zu definieren, die, wenn man es weiterdenkt, im Sinne einer besseren Prognose mit der „klassischen Therapie“ übertherapiert sind. Ein anderes interessantes Ziel für innovative Ansätze in Diagnostik und Therapie gastrointestinaler Tumorerkrankungen ist das anti-apoptotische Protein Survivin. Ich habe in meiner Arbeit sowohl bei Ösophaguskarzinompatienten als auch bei gastroenteropankreatischen neuroendokrinen Tumor-Patienten (GEP-NETs) eine Expression des Survivin- Proteins immunhistochemisch nachweisen können und außerdem als eine der ersten die Bedeutung der Lokalisation von Survivin erkannt und eine prognose- bestimmende Bedeutung der nukleären Lokalisation nachgewiesen. Interessanterweise zeigte sich in meinen Untersuchungen zu GEP-NETs Survivin dem Proliferationsmarker Ki-67 überlegen. Exemplarisch habe ich mir an einem der gefundenen Marker-Proteine die Karzinogenese genauer angeschaut. Hier lässt die häufige Überexpression des PBR in kolorektalen Karzinomen auf eine funktionelle Bedeutung des PBR in der Tumorentwicklung schließen. In dieser Arbeit konnte ich zeigen, dass PBR schon in frühen Adenomen (kleine Adenome mit geringgradigen Dysplasien) mit vergleichbarer Häufigkeit wie in Karzinomen hochreguliert ist. Ebenso häufig weisen Metastasen kolorektaler Karzinome eine PBR Überexpression auf. Dies lässt auf eine wichtige Rolle des PBR in der kolorektalen Karzinogenese und Metastasierung schließen. Die häufige Überexpression und prognostische Bedeutung des PBR könnte die Grundlage für neue PBR-basierte diagnostische und therapeutische Ansätze bilden. Diese Hypothese wurde anhand von ösophagealen und hepatozellulären Tumorzellinien untersucht. Immunhistochemisch konnten wir eine Überxpression des PBR in unseren Patientenkollektiven in 30% der Ösophaguskarzinome und 34% der hepatozellulären Karzinomen nachweisen, d.h. 1/3 dieser Patienten könnten demnach möglicherweise auf eine PBR-basierte Tumortherapie ansprechen. In dieser Arbeit konnte ich zeigen, dass die spezifischen exogenen PBR Liganden FGIN-1-27, PK 11195 und Ro5-4684 sowohl bei kolorektalen als auch bei ösophagealen und hepatozellulären Zellinien wachstumsinhibierende Wirkung zeigen. Darüber hinaus steigerten sie beim hepatozellulären Karzinom die antiproliferativen Effekte etablierter und experimenteller antineoplastischer Substanzen wie Paclitaxel, Docetaxel, Doxorubicin und des Bcl-2 Inhibitors HA14-1. Die Wirksamkeit der PBR Liganden lag bei allen untersuchten Tumorentitäten (Kolorektum, Ösophagus, Leber) im ähnlichen Konzentrationsbereich. Ihre antiproliferativen Effekte beruhten sowohl auf einer Induktion der mitochondrienvermittelten Apoptose als auch auf einer Arretierung des Zellzyklus über Stabilisierung von p21Cip1 und p27Kip1 mit folgender verminderter CyclinD1 Expression, transienter Deaktivierung der MAPKinase ERK1/2 und Induktion der Expression des cdc16, eines Kernproteins des anaphase-promoting complex.. Dies lässt auf gemeinsame Signalwege schließen. Viele, bei anderen Tumorarten bekannt veränderte Gene wie z.B. der k-ras-Signalweg, der bei über 90% der pankreatischen nicht-endokrinen Karzinome eine Rolle spielt, ist bei GEP-NETs nur von untergeordneter Bedeutung. Die Abgrenzung zwischen schlecht differenzierten, hochmalignen neuroendokrinen Karzinomen (definiert als WHO Klasse III), schlecht differenzierten kolorektalen Adenokarzinomen (ohne neuroendokrine Differenzierung) und „normalen“ kolorektalen Adenokarzinomen, die in 20-40% der Fälle eine neuroendokrine Differenzierung aufweisen können, ist schwierig und bisher die Domäne der immunhistochemischen Pathologie. Ich habe in dieser Arbeit anhand von etablierten (Synaptophysin, Chromogranin) und neuen neuroendokrinen Markern (Proteine des sogenannten SNARE-Komplexes) zeigen können, dass deren Expression im Zuge der malignen Transformation unterschiedlich lange erhalten bleibt: Chromogranin A scheint hierbei der am wenigsten verlässliche Marker zu sein. Zusätzlich scheinen die GEP-NETs der WHO-Klasse III tumorbiologisch noch deutlich „maligner“ zu sein, was sich in einer noch schlechteren Prognose als bei den schlecht differenzierten kolorektalen Adenokarzinomen (ohne neuroendokrine Differenzierung) niederschlägt. In einer anderen Arbeit an einer größeren Patientengruppe von 38 neuroendokrinen Tumoren/Karzinomen, 35 schlecht differenzierten kolorektalen neuroendokrinen Karzinomen und 150 sporadischen kolorektalen Karzinomen konnten wir zeigen, dass diese Tumorentitäten trotz einiger moleklarer Ähnlichkeiten auch deutliche molekulare Unterschiede aufwiesen, wie z.B. die p16 Promoter-Methylierung. In meiner Arbeit habe ich auch andere Zykline und Zyklin-abhängigen Kinasen, und die Rolle ihrer Inhibitoren, wie zum Beispiel p27 und p21 untersucht. Wir sehen die gut differenzierten neuroendokrinen Tumore und Karzinome (WHO Klasse I und II) als völlig – auch molekulargenetisch – abzugrenzen von den Karzinomen der WHO Klasse III. P27 im Verbund mit CyclinE als Marker der aktivierten CDK2-Komplexe kann bei den Karzinomen der WHO Klasse II Patienten mit einer deutlich schlechteren Prognose identifizieren. Dies konnten wir in Zellkultur-Experimenten mit p27siRNA an neuroendokrinen Tumorzellinien nachvollziehen. Hier könnten sich weitere innovative therapeutische Ansätze ergeben, z.B. durch Gentransfer von p27.

Patients with gastrointestinal tumors have a variable prognosis which is mostly dependent on the tumor staging (TNM classification). Biomarkers which are reliable and predictive for the response to a certain therapy or prognostically important are lacking. Therefore I have worked on new targets for diangosis and therapy of gastrointestinal tumor patients. First I have identified the overexpression of the peripheral benzodiacepine receptor (PBR) in colorectal cancer patients as a relevant prognostic important factor. Moreover, the presence of neuroendocrine differentiation, overexpression of the sialyl-Lex antigen, the low BAX protein expression, and the p53 mutational status were identified as important prognostic factors in colorectal cancer. We were able to demonstrate that in colorectal cancer multimarker analysis is superior to unimarker analysis in predicting prognosis. The discriminant function derived allows to stratify patients according to risk. The analysis of the anti-apoptotic protein survivin is of relevance in patients with esophageal cancer as well as in patients with gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors (GEP-NETs): A high expression of survivin is associated with a worse outcome for these patients. Even more important is the localization of the protein expression within the cell: Only the nuclear expression is of prognostic relevance in our patient collectives. We found that survivin was superior in predicting prognosis in relation to the ki67 index in GEP-NET patients. In terms of carcinogenesis, we found the PBR to be overexpressed in 86% of early and late adenomas. Furthermore, 85% of primaries and of 86% of metastases displayed PBR overexpression. PBR overexpression was also detected at the mRNA level as revealed by real-time PCR. The extent of PBR protein overexpression was equivalent in colorectal adenomas and carcinomas but slightly increased in metastases. These data suggest a functional role of PBR during colorectal carcinogenesis and tumor spread. Thus, PBR qualifies as a target for innovative diagnostic and therapeutic approaches. To prove this hypothesis we examined the role of proapoptotic PBRligands in HCC, colorectal and esophageal tumors and tumor cell lines. PBR was localized to the mitochondria both of HCC cell lines and tumor tissues of HCC patients. In contrast, normal liver did not express PBR. PBR ligands inhibited the proliferation of HCC cell lines by inducing apoptosis and cell cycle arrest. Apoptosis was characterized by a breakdown of the mitochondrial membrane potential, caspase-3 activation and nuclear degradation. Furthermore, pro-apoptotic Bax was overexpressed while anti-apoptotic Bcl-2 and Bcl-XL were suppressed. Cell cycle was arrested both at the G1/S- and G2/M-checkpoints. Synergistic anti-neoplastic effects were obtained by a combination of PBR ligands with cytostatic drugs (paclitaxel, docetaxel, doxorubicin), or with an experimental Bcl-2 inhibitor. Moreover, PBR ligands sensitized HCC cells to taxans and doxorubicin. Expression of PBR was also detected both in cell lines and in primary cell cultures of human esophageal cancers. Again, PBR was localized in the mitochondria. The PBR-specific ligands FGIN-1-27 and PK 11195, but not the centrally acting benzodiazepine clonazepam or the indolacetamide FGIN-1-52, neither of which displaying any affinity to the PBR, inhibited cell proliferation. FGIN-1-27 and PK 11195, but not clonazepam, potently induced apoptosis. FGIN-1-27 was shown to sequentially decrease the mitochondrial membrane potential, then to activate caspase-3 and finally to cause DNA fragmentation. In addition, PBR-specific ligands induced cell cycle arrest in the G1/G0 phase. The PBR ligand-mediated signaling in colorectal tumor cell lines involved the upregulation of the cyclin-dependent kinase inhibitors p21Waf1/CIP1 and p27Kip1, cdc16, and the cell cycle inhibitors gadd45 and gadd153, the downregulation of the cyclins D1 and B1, as well as the inactivation of ERK1/2. Finally I analyzed the genetic background of poorly differentiated neuroendocrine carcinomas (WHO class III) in comparison to poorly differentiated adenocarcinoma of the colon and rectum and their well-differentiated neuroendocrine tumor counterparts. From our studies we conclude that molecular pathogenesis in sporadic CRCs and colonic NETs is different despite few similarities. Main differences between colon- and fore-/midgut NETs are the ki-67 proliferation rate and differential methylation in tumor associated genes. Predictors of a poor outcome in NETs are site (colon) a high ki-67 proliferation index and p16 methylation. Vice versa, a high p27 expression and a low cyclin E expression as found in well differentiated neuroendocrine tumors and carcinomas predict a good prognosis for those patients. This could be proven by cell culture experiments using p27 siRNA. These results build the basis for new individually adapted therapies for our patients.