Localization and Characterization of Murine Memory B Lymphocytes

Abstract

Memory B Lymphocytes are cells of the immune system which propagate one of its key features: Immunological memory, that is an organisms’ ability to respond in a more rapid and enhanced manner to an antigenic stimulus it has encountered before. Memory B cells have expanded in response to antigen and remain stably present in an organism over long periods. It is the aim of this thesis to elucidate the validity of the general concept of memory immune cells – like plasma cells or CD4 and CD8 memory T cells – resting in specialized cellular niches for the maintenance of memory B cells. Murine Memory B cells in the spleen, bone marrow, lymph nodes and peripheral blood were quantified in laboratory mice which had received different imunizations and in wild and pet mice which did not live under pathogen-reduced SPF conditions. As expected, large numbers of memory B cells were localized in the spleen, but a prominent population was found in the bone marrow. To understand and compare the conditions of their survival in both organs, memory B cells from spleen and bone marrow were isolated and profiled for gene transcription, expression of surface markers as well as their B cell receptor repertoire. In terms of gene transcription and surface marker expression, memory B cells from spleen and bone marrow were very similar. However, memory B cells from the bone marrow had a more differentiated memory phenotype and express higher levels of CD80 and PD-L2, but less CD62L and CD21. Memory B cells of the spleen had a more activated phenotype and whereas bone marrow memory B cells expressed the transcription factors Foxp1 and Myb for maintenance and for suppression of apoptosis. Bone marrow memory B cells were resting in the G0 phase of the cell cycle, whereas memory B cells in the spleen did not, as shown by expression of the cell cycle marker Ki-67. For the first time this provides evidence for the existence of a resting population of memory B cells in the murine bone marrow. To address the hypothesis that there may be a role for memory B cells in antigen presentation to memory T cells, dendritic cells were depleted in a recall response to NP-KLH. If the antigen is applied IV through the blood stream, dendritic cells are dispensible for efficient secondary antibody response. No difference was found in the extent of somatic hypermutations per V gene. However, the comparison of the B cell receptor repertoire from spleen and bone marrow memory cells revealed limited overlap in CDR3 sequences. This demontrates that both compartments harbor memory cells with different specificities which rules out extensive exchange of cells between the memory populations of both organs. In contrast to the notion of recirculating B cell memory, it could be shown that a separate resting population within the B cell memory compartment exists in the bone marrow. Memory B cells in spleen and bone marrow differ in a number of features leading to the concept that the bone marrow is resting and spleen memory B cells are in a pre-activated state and have higher migratory capacity and are probably the origin of the recirculating memory cells in the periphery.

Gedächtnis-B-Zellen sind Immunzellen, die an der Aufrechterhaltung des immunologischen Gedächtnis beteiligt sind. Darunter versteht man die Fähigkeit eines Organismus einem bereits bekannten Antigen mit einer schnelleren und stärkeren Immunreaktion zu begegnen. Gedächtnis-B-Zellen verbleiben nach ihrer Expansion in einer Immunantwort für lange Zeit im Organismus. Ziel dieser Arbeit ist es, der Frage nachzugehen, ob auch für Gedächtnis-B-Zellen das allgemeine Konzept gilt, nach dem die Gedächtniszellen des Immunsystems, Plasmazellen oder CD4- und CD8-Gedächtniszellen, in spezialisierten zellulären Nischen überleben. Dazu wurden Gedächtnis-B-Zellen aus Milz, Knochenmark, Lymphknoten und Blut von Mäusen isoliert, die zuvor nach verschiedenen Protokollen immunisiert worden waren und aus wilden sowie aus einer Tierhandlung stammenden Mäusen, die nicht unter SPF-Bedingungen gehalten wurden. Wie erwartet konnten Gedächtnis-B-Zellen in großer Zahl in der Milz aufgefunden werden. Aber daneben existiert eine große Population im Knochenmark. Zur Aufkärung der Unterschiede wurde Gedächtnis-B-Zellen beider Populationen isoliert und Transkriptionsprofile, eine Analyse der Expression von Oberflächenmarkern und die Sequenzierung des B-Zell-Rezeptor-Repertoires durchgeführt. Hinsichtlich der Gentranskription und der Oberflächenmarker sind die Gedächtnis-B-Zellen der Milz und des Knochenmarks einander sehr hnlich. Allerdings zeigten die Gedächtnis-B-Zellen des Knochenmarks einen differenzierteren Gedächtnisphänotyp und exprimierten mehr CD80 und PD-L2 aber weniger CD62L und CD21. Die Gedächtnis-B-Zellen der Milz wiesen einen aktivierteren Phänotyp auf, während Gedächtnis-B-Zellen des Knochenmarks die Transkriptinsfaktoren Foxp1 und Myb zur Unterdrückung der Expression apoptotischer Gene und Homöostase exprimieren. Knochenmarks- Gedächtnis-B-Zellen ruhen in der G0 -Phase des Zellzyklus, das gilt für Gedächtnis-B-Zellen aus der Milz nicht, wie die Expression des Proliferationsmarkers Ki-67 zeigt. Um die Hypothese zu prüfen, dass Gedächtnis-B-Zellen eine Rolle in der Antigenpräsentation spielen könnten, wurden im Kontext einer Gedächtnisatwort gegen das Antigen NP-KLH die dendritischen Zellen depletiert. Wird das Antigen i.v. in die Blutzirkulation appliziert, sind dendritische Zellen für eine effektive Sekundärantwort nicht nötig. Hinsichtlich der Anzahl der Mutationen in den V-Regionen der schweren Immunglobulin-Ketten bestanden keine Unterschiede zwischen Milz- und Knochenmarks-Gedächtnis-B-Zellen. Der Vergleich der CDR3-Verteilung zeigte eine sehr begrenzte Zahl an Sequenzen, die in beiden Populationen aufgefunden wurden und große Unterschiede in der Verteilung auf beide Organe. Das zeigt, dass ein Austausch zwischen den beiden untersuchten Kompartimenten des B-Zell- Gedächtnis nicht in großem Ausmaß stattfindet. Im Gegensatz zum gegenwärtigen Verständnis eines rezirkulierenden B-Zell-Gedächtnis, konnte in dieser Arbeit die Existenz eines eigenständig neben dem rezirkulierenden Anteil bestehenden ruhenden Bestandteil des B-Zell-Gedächtnisses im Knochenmark gezeigt werden. Gedächtnis-B-Zellen in Milz und Knochenmark unerscheiden sich in etlichen Eigenschaften. Daraus lässt sich das Konzept einer Aufteilung des B-Zell- Gedächtnisses ableiten, in dem das Knochenmark den ruhenden, nicht proliferierenden Teil beherbergt und der prä-aktivierte Anteil sich in der Milz aufhlt, über eine höhere Migrationsneigung verfügt und wahrscheinlich den durch die Peripherie rezirkulierenden Teil des B-Zell-Gedächtnisses auffüllt.