Adulte Stammzellen in humanen Schilddrüsengeweben: Isolierung, Propagierung und Analyse von Expressionsprofilen im Vergleich zu differenzierten Thyreozyten und Schilddrüsenkarzinomzellen

Abstract

Die embryonale Herkunft der Thyreozyten liegt in der Schilddrüsenanlage, was dem entodermalen Keimblatt entspringt und in der hinteren Schlundtasche lokalisiert ist. In der vorliegenden Arbeit wurden adulte Stammzellen entodermaler Herkunft in Schilddrüsenzellkulturen nachgewiesen und in ihrem Expressionsmuster analysiert. Diese Zellen stellen Vorläuferzellen der diferenzierten Thyreozyten dar. Wir wählten Stammzellmarker, die einerseits pluripotente Stammzellen (Oct4, p63) und andererseits multipotente entodermale Vorläuferzellen (HNF4a, GATA-4) der Schilddrüse charakterisieren. Fehlende Expression von Connexin 43, einem Transmembranprotein, was mit dem Verlust einer funktionsfähigen Interzellkommunikation einhergeht, scheint ebenfalls adulte Stammzellen zu charakterisieren. Durch RT-PCR, Immunzytochemie und Durchflußzytometrie wurde eine geringe Anzahl von Zellen, positiv für die beschriebenen Stammzellmarker, detektiert. Die gefundenen Zellen weisen Hauptmerkmale einer adulten Stammzelle auf: ihr undifferenzierter Charakter ( demonstriert durch die Expression pluri- und multipotenter Marker), ihre Selbsterneuerungskapazität(demonstriert durch die Fähigkeit der Zellen, auch nach mehrfachen Passagen in Kultur zu überleben) und der Verlust einer funktionellen Interzellkommunikation (demonstriert durch fehlende Connexinexpression). Die Zahl der in Kultur nachgewiesenen Stammzellen konnte durch veränderte Kulturbedingungen (Östrogen, Xhantosin) beeinflusst werden. Um vitale adulte Stammzellen mittels FACS zu gewinnen färbten wir die Schilddrüsenzellkulturen mit dem fluoreszenten DNS Bindungsfarbstoff Hoechst 33342. Sehr wenige Zellen der sogenannten Side Population ( Seitenpopulation) konnten von der Non Side Population unterschieden werden. Die Zellen der Side Population zeigen eine typische Genaktivität für adulte Stammzellen. Es sind noch eine Reihe von Experimenten notwendig, um die für die isolierten adulten Stammzellen optimalen Kulturbedingungen herauszufinden, um eine proliferierende Stammzellkultur in vitro zu erzeugen und deren Differentiationspotential zu untersuchen.

The thyroid gland develops from an endodermal mass in the floor of the primitive pharynx before it migrates to the front of the trachea. In the present work we provided evidence for the presence of adult stem cells from endodermal origin in cultured cells derived from human goiters. These cells are putative precursors of differentiated thyroid follicular cells. We chose a set of stem cell markers, which characterize pluripotent stem cells (Oct4, p63) and multipotent endodermal precursors (HNF4a, GATA-4) of the thyroid. The loss of the transmembrane protein connexin 43, responsible for intercellular communication, means to be another characterism of adult stem cells. Using reverse transcription (PCR), immunocytochemistry and flow cytometry, rare cells were detected expressing the mentioned markers. These cells display some basic stem cell properties: undifferentiated state (demonstrated by the expression of pluri- and multipotency markers) , self- renewal capacity (demonstrated by the ability of the cells to survive in culture even after an increased number of passages) and the loss of functional intercellular communication (demonstratet by the loss of connexin 43). The quantity of adult stem cells in cultur were involved by different culture conditions (estrogen, xhantosin). To analyse and isolate vital stem cells by FACS we used the effective strategy of staining the cultured thyroid cells with the DNA dye Hoechst 33342. The rare cells of the side population could be separated from the non side population. The side population expressed the typical gene profile of adult stem cells. More experiments are necessary to establish optimal culture conditions to proliferate stem cells in culture and last but not least to show their differentiation potential.