Identifizierung differentiell exprimierter Gene in Tumoren der Prostata und Harnblase

Abstract

Das Prostatakarzinom ist der häufigste maligne Tumor des Mannes. Sein Auftreten, vor allem im hohen Alter, rückt ihn bei einer steigenden Lebenserwartung der Bevölkerung weiter in den Mittelpunkt des Interesses. Zur Analyse dieses Tumors wurde das Expressionsprofil des Tumor- und Normalgewebes von 54 Prostatapatienten durch Affymetrix-Chiphybridisierungen untersucht. Aus den mikrodissezierten Tumor- und Normalgeweben wurde die Poly-A+-RNA präpariert und in aufeinander folgenden Runden von cDNA-Synthese und in vitro Transkription linear amplifiziert. Die Chipdaten der 108 Patientengewebe wurden mit einem speziell entwickelten Algorithmus ausgewertet und führte zur Identifikation von 124 in Prostatatumoren herunterregulierten und weiteren 104 in Tumoren hochregulierten Sequenzen, die in einer Gruppenanalyse (Clusteranalyse) untersucht wurden. Die Clusteranalyse zeigte eine deutliche Trennung der Tumor- von ihren korrespondierenden Normalgeweben mit einer Sensivität von 94% bei einer Spezifität von 72%. Eine Auftrennung der Gewebe entsprechend ihrer histologischen Klassifikationen wie auch eine Gruppierung der Tumorproben entsprechend ihres Grades und Stadiums war nicht in allen Fällen möglich, da die histologischen Merkmalen nicht eindeutig mit den molekularen Profilen übereinstimmten. Für eine nähere Untersuchung wurden aus der Liste der in den Prostatatumoren herunterregulierten Gene drei ausgesucht und ein viertes auf Grund einer ähnlichen Funktion ausgewählt. Die Herunterregulation des WIF-1 in den Prostatatumoren war sehr deutlich und konnte auch in Brust- und Lungentumoren gezeigt werden. Die Ursache der Herunterregulation ist unbekannt, da WIF-1 in der Region 12q14.3 lokalisiert ist, für die in Prostatatumoren bisher noch keine chromosomalen Aberrationen identifiziert wurden. Immunhistochemische Färbungen von Prostata- und Harnblasentumoren konnten den Verlust der Expression in einem Teil der Tumoren bestätigen. Aus dem Signalweg der Wnt-Proteine konnte das sFRP1 als ein weiteres Gen, mit einer ähnlichen Funktion wie WIF-1, auf dem Chip identifiziert werden. sFRP1 zeigte keine Regulation in Prostatatumoren, ist jedoch in der häufig in Harnblasentumoren verlorenen Region 8p11.22 lokalisiert. Die reduzierte Genexpression in Blasentumoren konnte in Northern- Hybridierungen gezeigt werden und LOH-Untersuchungen bestätigten den häufigen Verlust der Region. Immunhistochemische Untersuchungen mit einem sFRP1-Antikörper zeigten den Verlust der Expression in 26% der untersuchten Harnblasentumore. Als drittes Gen mit einer Herunterregulation in Prostatatumoren wurde das Chimerin-1 ausgewählt, das eine hemmende Wirkung auf die Signalweiterleitung Ras-ähnlicher Rho-Proteine hat. Auch für dieses Gen konnte die differentielle RNA-Expression bestätigt werden. Für das Adaptorprotein Ponsin konnte die differentielle Expression in RNA-Studien bestätigt werden, die Proteinexpression zeigte sich jedoch nicht als differentiell zwischen Normal- und Tumorepithelien, sondern wies auf ein methodisches Problem der manuellen Mikrodissektion hin. Auch konnte in einer LOH-Untersuchung kein signifikanter Hinweis auf einen Verlust des Gens gefunden werden.

The carcinoma of the prostate is the most frequent tumor among men. Its appearance mainly with higher age has moved it to the focus of cancer research because of the rising life expectancy of the population. For the analysis of this type of tumor the expression profile of normal and tumor tissues from 54 patients was analyzed by Affymetrix chip hybridisations. After microdissection of normal and tumor tissue the poly-A+-RNA was prepared, linear amplified in repetitive rounds of cDNA synthesis and in vitro transcription. The chip data of 108 patient tissues were analysed by a special devolved algorithm and led to the identification of 124 sequences that were down regulated and further 104 sequences with an up regulation in prostate tumors, that were analyzed by cluster analysis. The cluster analysis showed a distinct separation of tumor from its corresponding normal tissue with a sensitivity of 94% and a specificity of 72%. Separation of the tissues according to their histological classification and clustering the tumors according to their grad and stage was not possible in all cases, because the histological features did not harmonize with the molecular profile. For a detailed analysis of down regulated genes in prostate tumors, three were selected from this group and a fourth gene was chosen because of its similar function. The down regulation of WIF-1 in prostate tumors was very clear and could also be shown for breast and lung tumors. The reason for the down regulation is not known. WIF-1 is located in the region 12q14.3, this area has up to now not been correlated with any chromosomal aberration in prostate tumors. Immunohistochemical staining of prostate and bladder tumors confirmed the loss of expression in a subset of tumors. From the Wnt-signal transduction pathway the gene sFRP1 could be identified on the chip as a further gene with a similar function to WIF-1. sFRP1 shows no differential expression in prostate tumors, but is located in the region of 8p11.22 which is often lost in bladder tumors. The reduced gene expression in bladder carcinomas could be shown in Northern blots and LOH analysis confirmed the loss of the region. Immunohistochemical analysis with an sFRP1-Antibody showed the loss of expression in 26% of the analyzed bladder tumors. As a third gene with a down regulation in prostate tumors Chimerin-1 was chosen to be studied more closely because of its suppressing function on the signal transduction of the Ras-related Rho-Proteins. The differential RNA- expression for this gene could be confrimed. For the adaptor protein Ponsin the differential RNA expression could be confirmed, but the protein expression was not differential between normal and tumor epithelia and this highlighted a possible methodical problem of manual microdissection. The LOH-analysis gave no significant result for a loss of the gene.