Genexpression Follikulärer Dendritischer Zellen und Analyse ihrer ontogenetischen Entwicklung

Abstract

In der humoralen Immunantwort spielen Follikuläre Dendritische Zellen (FDC) durch Präsentation von unprozessiertem Antigen, Signalübermittlung und direktem Zell-Zell-Kontakt mit B-Zellen eine zentrale Rolle. So unterstützen FDC im Primärfollikel B-Zell-Entwicklung und -Homöostase und im Keimzentrum eines Sekundärfollikels die Affinitätsreifung der Immunantwort. Aufgrund der Ausbildung eines dichten Netzwerkes aus langen Zellfortsätzen, über die FDC im engen Kontakt mit B-Zellen stehen, ist die Isolierung von FDC mit signifikanter Homogenität problematisch und somit die Charakterisierung dieses Zelltyps schwierig. In dieser Arbeit wurde unter Verwendung der Laser- unterstützten Mikrodissektion eine neue Methode zur Isolierung von FDC etabliert, die eine Anreicherung von FDC ex vivo zusammen mit B-Zellen aus Primärfollikeln und Keimzentren ermöglicht. Parallel wurden in einem Ansatz Follikuläre bzw. Keimzentrums-B-Zellen sortiert. Von den FDC- und B-Zell- Präparationen wurde das Transkriptom mittels Microarray ermittelt und FDC- spezifische Gene durch Verwendung verschiedener Algorithmen bioinformatisch analysiert. Die spezifische Expression der neu identifizierten Gene in FDC wurde mit in situ-Hybridisierung und Immunhistologie bestätigt. Eine anschließende Analyse verschiedener Mausmodelle mit einer Defizienz für eine Auswahl dieser Gene gab Auskunft über die funktionelle Rolle der neu identifizierten FDC-Gene in der B-Zell-Homöostase und Keimzentrumsreaktion. Die Milzentwicklung neugeborener Mäuse als auch verschiedene Mausmodelle zeigten unter Verwendung der neu identifizierten FDC-Gene, dass FDC einen gemeinsamen Ursprung mit follikulären Stromazellen, sowie Stromazellen des Marginalsinus, der T-Zone und der Roten Pulpa teilen. Hierbei konnte eindeutig eine stufenweise Entwicklung der FDC aus residualen Stromazellen nachgewiesen werden. Darüberhinaus zeigten unsere Analysen, dass in einem bestimmten Zeitfenster der neonatalen Milzentwicklung B-Zellen und ihre definierten Wechselwirkungen mit kolokalisierenden Stromazellen wichtig für die Differenzierung von reifen FDC sind.

Follicular Dendritic Cells (FDC) play a central role within the humoral immune response by presentation of non-processed antigen, cell signalling and immediate cell-cell-contact with B cells. In the primary follicle FDC support B cell development and homeostasis, in germinal centre of secondary follicle the process of affinity maturation. Due to the formation of a dense network with long dendritic processes and the close interaction with B cells, the isolation of FDC to significant homogeneity is problematic and subsequently the characterisation of this cell type difficult. Using Laser Capture Microdissection a new method to isolate FDC was established. This technique allowed an enrichment of FDC ex vivo along with B cells from primary follicles and germinal centres. In parallel follicular and germinal centre B cells were sorted. The transcriptoms of FDC and B cell preparations were identified by microarray analysis and genes specific for FDC were bioinformatically ascertained applying several algorithms. The specific expression of newly identified genes in FDC was determined by in situ hybridisation und immunohistology. The analysis of several mouse models deficient for a selection of these genes elucidated the functional role of the newly identified FDC genes in B cell homeostasis and germinal centre reaction. In addition, the development of the immune compartment in spleens of newborn mice and several mouse models were analysed using the newly identified FDC genes. The obtained data demonstrate that FDC develop stepwise from residual stromal cells and share a common origin with follicular stromal cells and marginal sinus layer cells as well as stromal cells of the T zone and the red pulp. Moreover, it could be shown that in a defined time window of neonatal splenic development a specific crosstalk between B cells and co-localising stromal cells is essential for the differentiation of stromal cells into mature FDC.