Repopulations-Phänomen – Austausch ortständiger Mikrogliazellen mit peripher rekrutierten myeloischen Zellen am HSVTK-Mausmodell

Abstract

Hintergrund/Ziel: Unter physiologischen Bedingungen stellen Mikrogliazellen eine sich langsam selbstreplizierende Zellpopulation dar, die weitestgehend unabhängig von äußeren Einflüssen ihren Bestand aufrechterhält. Bei bestimmten Pathologien können monozytäre Zellen die BHS durchtreten und an einer neuroimmunologischen Antwort mitwirken. Beispielsweise tragen periphere Immunzellen zur Pathologie der Multiplen Sklerose bei. Auch bei neurodegenerativen Erkrankungen, wie der Alzheimerschen, können monozytäre Zellen aufgrund einer defekten BHS ins Gehirn eindringen. Die pathophysiologische Rolle dieser ins Gehirn einwandernden Zellen ist allerdings nicht detailliert erforscht. Ziel dieser Arbeit ist es, mit Hilfe der CD11b-HSVTK-Maus die Mikrogliazelldepletion zu etablieren, um den Vorgang der sich anschließenden Wiederbesiedlung des Gehirns genauer zu untersuchen. Anschließend wird die Anwendbarkeit dieser neuartigen Methode zum Studium von ZNS-Pathologien aufgezeigt. Dafür untersuchen wir den Einfluss dieses Eingriffs in die Mikrogliaphysiologie auf die cerebrale Amyloid-Pathologie in einem Alzheimer-Mausmodell. Methoden: Die 10tägige intracerebroventrikuläre Ganciclovir (GCV)-Gabe („Depletion“) mit sich anschließender zweiwöchiger Unterbrechung („Repopulation“) wurde bei CD11b-HSVTK-Mäusen etabliert. Ferner wurde das Knochenmark von HSVTK-Mäusen durch Knochenmark von actin- eGFP+-Mäusen ersetzt. Die Knochenmark-Chimären wurden in Gruppen entsprechend ihrer GCV-Behandlungs-Protokolle mit anschließender Tötung eingeteilt: \- 10tägige Gabe; („Depletion“) \- 10tägige Gabe, 14tägige Behandlungsunterbrechung; („Repopulation“) \- 10tägige Gabe, 50tägige Behandlungsunterbrechung; („Langfristige Repopulation“) Zuletzt wurden APPPS1 -HSVTK-Mäuse Gruppen zugewiesen, um folgendermaßen mit GCV behandelt zu werden: „Depletion“; „Repopulation.“ Hirngewebe wurde immunhistochemisch angefärbt und stereologisch quantifiziert. Ergebnisse: Ortständige Mikrogliazellen sind nach 10tägiger GCV-Gabe bei HSVTK+/- (TK)-Mäusen zu 70 % depletiert. Danach erfolgt die ZNS-Repopulation Iba-1+ wieder-besiedelnder Zellen, indem die GCV-Behandlung für zwei Wochen unterbrochen wird (90%ige Zunahme Iba-1+ Zellen, verglichen mit Kontrollmäusen). Diese wiederbesiedelten Zellen weisen einen monozytären Phänotyp auf. Um die Herkunft wiederbesiedelter Zellen zu untersuchen, werden HSVTK-Tiere mit GFP- exprimierenden Knochenmarkszellen rekonstituiert und mit dem GCV-„Repopulations“-Protokoll behandelt. Die stereologische Analyse markiert eine 88%ige Erhöhung Iba-1+ Zellen bei rekonstituierten TK- verglichen mit wt- Mäusen. Zudem sind bei rekonstituierten TK-Mäusen annähernd alle Iba-1+ Zellen, auch GFP+, was die periphere Herkunft dieser Zellen verdeutlicht. Ferner verändert sich die Morphologie eingewanderter Zellen: der zu Wiederbesiedlungsbeginn monozytäre Phänotyp gleicht sich nach längerfristiger, 50tägiger ZNS-Anwesenheit der Mikrogliazellmorphologie an. Auch werden APPPS1 -TK-Mäuse mit dem GCV-„Depletions“ und „Repopulations“-Protokoll behandelt. Bei der Kongorot bedeckten Fläche zeigt sich kein signifikanter Unterschied an APPPS1-TK-Mäusen, versus Kontrollen in den zwei Gruppen. Schlussfolgerung: Mit Hilfe der CD11b-HSVTK-Maus wird das endogene Immunsystem des Säugergehirns ausgetauscht: Unterbrechung der Ganciclovir-Behandlung führt nach Mikrogliazelldepletion zur ZNS-Wiederbesiedlung durch peripher rekrutierte myeloische Zellen. Allein die Existenz des sogenannten Repopulations-Phänomens verdeutlicht, wie essentiell Mikrogliazellen im Gehirnmilieu des Tieres sind. Diese neuartige Methode kann beispielsweise verwendet werden, um zu untersuchen, ob sich von peripher rekrutierte myeloische Zellen und Mikrogliazellen in ihrer Fähigkeit unterscheiden, Aβ-Plaques im Alzheimer- Mausmodell zu beseitigen.

Introduction: Under normal physiological conditions, the microglia population is maintained by self-replication of existing cells independent of external influences. Certain diseases are characterized by monocyte recruitment into the CNS. For instance, peripheral cells contribute to the pathology in MS. Also in neurodegenerative diseases, e.g. AD, circulating monocytes enter the CNS due to BBB defects. The impact of peripheral macrophages on many disease states remains unknown. The aim of this study is to establish microglia depletion in order to further investigate the subsequent repopulation of the brain with peripherally-derived myeloid cells utilizing CD11b-HSVTK-mice. Subsequently we show the applicability of this novel experimental method by examining the impact of peripherally-derived macrophages on cerebral Aβ plaque load in an AD mouse model. Methods: Intracerebroventricular delivery of GCV to HSVTK-mice for 10d (“depletion”), following cessation of GCV-treatment for 14d (“repopulation”) was established. HSVTK-bone marrow chimeras harboring GFP+ bone marrow were randomly divided into groups regarding GCV-treatment and subsequent sacrifice: \- 10d GCV-treatment; “depletion” \- 10d GCV-treatment, 14d cessation of treatment; “repopulation” \- 10d GCV-treatment, 50d cessation of treatment; “long-term repopulation” APPPS1-HSVTK-mice were treated with identical “depletion”/ “repopulation”-protocols. Brain tissues were stained with immunohistochemistry and stereologically quantified. Results: After 10d of GCV-treatment 70 % of resident microglia were depleted in HSVTK+/- (TK)-mice. Cessation of GCV-treatment for 14d resulted in repopulation of the microglia-depleted CNS with Iba-1+ repopulating cells that were 90 % more numerous than in identically treated wt-control-mice. The repopulating cells displayed a distinct morphologic phenotype, characteristic of macrophages. In order to investigate the source of repopulating cells HSVTK-bone marrow chimeras harboring GFP+ bone marrow were treated with the GCV-“repopulation”-protocol. Iba-1+ cells were 88 % more numerous in TK-mice than in identically treated wt-control-mice. In contrast to identically treated controls nearly all Iba-1+ cells were also GFP+ in TK-mice, underscoring the peripheral source of repopulating cells. The distinct monocyte phenotype of freshly invaded cells adopted a more “microglia-like” morphology in TK-mice treated with the “long-term repopulation”-protocol. Morphometric quantification of the congo red covered area did not reveal any significant difference in APPPS1-TK-mice versus identically treated controls in all treatment-groups. Conclusion: This work describes the exchange of the endogenous immune system in the mammalian brain: following cessation of GCV- treatment, peripheral myeloid cells rapidly repopulate the CNS after depletion of resident microglia in CD11b-HSVTK-mice. The existence of this repopulation- phenomenon underlines the crucial importance of microglia within the brain environment. For instance, this novel method can be used to examine, if microglia versus peripheral myeloid cells differ in their capability to clear Aβ plaque load in an AD mouse model.