Off-target identification for a multitarget kinase inhibitor by Chemical Proteomics

Abstract

An unbiased Chemical Proteomics approach for the identification of non-protein kinase off-targets of the multitarget protein kinase inhibitor C1 is presented. Two different compound immobilization routes were applied in order to identify off-targets interacting with distinct compound moieties. Furthermore, a soluble mimic of the immobilized compound was employed to confirm an appropriate compound immobilization with regard to protein kinase capturing. After having captured several protein kinases by using C1-matrix, 27 kinases were selected for a biochemical selectivity screen. A strong enzyme inhibition was found for the CDKs, demonstrating a high inhibitory potency, as well as for several other kinases from different kinase families indicating a poor selectivity of that compound. Besides this, several kinases which were captured by the C1-matrix showed only a low inhibition in the selectivity studies. Thus, an affinity capturing by the C1-matrix in the setup used for this study is not necessarily correlated with a high affinity binding but depends on both, affinity and expression level. In addition, a protein extract might differ from the physiological conditions with regard to the physico- chemical behavior of the proteins. Moreover, an indirect capturing of proteins via their association to other target proteins and protein complexes might occur. The low inhibitiory potency of C1 toward some kinases initially identified by the affinity pull-down and the identification of cyclins which are known to form complexes with CDKs support this assumption. This underlines the essential need for additional methods such as quantitative biochemical binding studies whenever reasonable in order to (de-)validate the results from affinity pull-down experiments. Furthermore, the mimic was applied to assess the functional effects of the linker on target binding. For this purpose, the mimic was screened in the same panel of kinases which was used for the selectivity studies of C1. The comparison of the selectivity patterns of compound and mimic revealed individual effects of the linker on distinct targets. Predominantly, the linker caused a reduction of inhibitory potential, very likely due to steric effects. However, some kinases showed an increased inhibition by the mimic compared to C1, presumably due to additional interaction options provided by the linker. Thus, a mimic helps to improve the data interpretation of Chemical Proteomics experiments, but it does not allow a general prediction of functional effects of the linker on target binding. Within this Chemical Proteomics approach, the human pyridoxal kinase (PDXK) was identified as being captured by C1-matrix. Interestingly, PDXK is described to bind to the CDK2 inhibitor (R)-roscovitine, as well. PDXK is a non-protein kinase, responsible for the phosphorylation of vitamin B6, a cofactor for numerous enzymes such as aminotransferases and decarboxylases. The PDXK/ C1 interaction was shown to occur at the substrate binding site rather than at the ATP site. However, subsequent quantitative binding studies including several C1 analogs revealed a very limited inhibition of PDXK activity. It was concluded that effects in pharmacological applications caused by a PDXK/ C1 interaction seem unlikely. By employing an alternative immobilization route of C1, the carbonic anhydrase 2 (CA2) was found among others to be captured by the C1a-matrix. Since the ubiquitous CA2 is inhibited by C1 in the submicromolar range (IC50), as demonstrated by subsequent activity assays, unwanted pharmacological effects or a trapping of the compound due to this interaction have to be taken into consideration. However, these results indicate that a modification at the sulfonamide group prevents CA2 from binding, most likely due to steric hindrance. To summarize, the utilization of different compound immobilization routes as a valuable method for an unbiased off-target profiling by Chemical Proteomics was introduced. By successfully applying this methodology, several off-targets interacting with distinct compound moieties were identified. The strategy of different compound immobilization routes can be employed for the target identification for hit compounds originating from phenotypic screens in cell-based assays or animal studies, as well. Thus, the utilization of different immobilization routes may become a useful tool for future off-target and target identification strategies.

Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung unbekannter sekundärer Zielproteine, so genannter off-targets, des multitarget Proteinkinase- Inhibitors C1 mit Hilfe eines ergebnisoffenen Chemical Proteomics-Ansatzes. Um off-targets zu finden, die an unterschiedliche Substanz-motive binden, wurde die Methodik der unterschiedlichen Immobilisierungsstrategien eingeführt. Darüber hinaus wurde ein so genanntes Mimik, d.h. eine lösliche Nachahmung der immobilisierten Substanz, verwendet, um die prinzipielle Eignung der gewählten Inhibitor-Kupplung hinsichtlich einer Anreicherung von Proteinkinasen zu zeigen und potentielle Linkereffekte zu untersuchen. Nachdem eine Reihe von Proteinkinasen angereichert und identifiziert werden konnten, wurden 27 davon für eine biochemische Selektivitätsstudie mit rekombinant hergestellten Enzymen ausgewählt. Zum einen wurde eine starke Inhibierung der Enzymaktivität der getesteten CDKs gefunden, womit das große inhibitorische Potential der Substanz gezeigt wurde. Zum anderen wurden auch bei einer Reihe weiterer Kinasen verschiedener Proteinkinase-Familien eine starke Abnahme der Enzymaktivität in Gegenwart des Inhibitors gefunden. Dies offenbarte die begrenzte Selektivität des Kinase-Inhibitors. Des Weiteren trat bei einigen Kinasen eine nur geringe Aktivitätsabnahme auf. Es wurde geschlussfolgert, dass die Anreicherung eines Proteins in dem für diese Arbeit verwendetem Chemical Proteomics-Ansatz nicht zwangsläufig mit einer hohen Affinität korreliert. Vielmehr scheint die Anreicherung von Proteinen in Abhängigkeit von der jeweiligen Affinität und Expressionsstärke zu erfolgen. Darüber hinaus könnte die Präparation eines geeigneten Proteinextraktes eine Veränderung des physiko-chemische Verhaltens der Proteine induziert haben. Auch eine indirekte Anreicherung von Proteinen über deren Assoziation mit anderen Zielproteinen und Proteinkomplexen kann nicht ausgeschlossen werden. Diese Annahme wird durch die Identifizierung von Cyclinen, von denen bekannt ist, dass sie feste Proteinkomplexe mit verschiedenen CDKs eingehen, untermauert. Diese Ergebnisse führten zu der Erkenntnis, dass weiterführende quantitative biochemische Bindungsstudien zur Validierung der Resultate aus Proteomics-Versuchen essentiell sind. Im Rahmen weiterer Untersuchungen wurde ein Mimik des gekuppelten Inhibitors verwendet, um funktionelle Effekte des Linkers auf das Binden der Zielproteine zu untersuchen. Dazu wurde das Mimik der gleichen Selektivitätsstudie wie zuvor die Substanz C1 unterzogen. Der Vergleich der beiden Selektivitätsmuster zeigte in der Mehrheit eine Abnahme der inhibitorischen Wirkung der Substanz infolge der Einführung des Linkers, vermutlich aufgrund von sterisch Effekten. Allerdings konnte vereinzelt auch ein Gewinn des inhibitorischen Potentials beobachtet werden. Hervorgerufen durch die funktionellen Gruppen des Linkers, traten bei den betroffenen Kinasen vermutlich zusätzliche Wechselwirkungen und einhergehend damit höhere Bindungsaffinitäten auf. Es wurde geschlussfolgert, dass ein Mimik hilfreich bei Interpretation der Daten aus Chemical Proteomics-Ansätzen ist, allerdings nicht die generelle Vorhersage von funktionalen Effekten des Linkers auf das Binden von Zielproteinen erlaubt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die humane Pyridoxalkinase (PDXK) als potentielles off-target des Inhibitors C1 identifiziert. Interessanterweise ist in der Literatur ein Binden dieses Enzyms an den CDK-Inhibitor (R)-roscovitine beschrieben. PDXK ist eine Nicht- Proteinkinase, die für die Phosphorylierung von Vitamin B6 verantwortlich ist. Dieses Vitamin ist ein essentieller Cofaktor für zahlreiche Aminotransferasen und Decarboxylasen. Es konnte gezeigt werden, dass die PDXK/ C1-Interaktion an der Substrat-Bindungsstelle auftritt und nicht, wie ursprünglich vermutet, über die ATP-Bindungsstelle vermittelt wird. In anschließenden Bindungsstudien wurde jedoch auch bei hohen Inhibitorkonzentrationen (50 µM) eine nur sehr begrenzte Enzym-Inhibition gemessen. Effekte in pharmakologischen Anwendungen des Inhibitors C1 aufgrund einer Wechselwirkung mit der Pyridoxalkinase erscheinen daher sehr unwahrscheinlich. Im Rahmen einer zweiten Immobilisierungsstrategie wurde eine alternative Inhibitor-Matrix generiert. Diese führte zur Identifizierung weiterer potentieller off-targets, darunter der Carboanhydrase 2 (CA2). In anschließende Enzym-Aktivitätsassays konnte eine starke Bindungsaffinität (IC50) im submikromolaren Bereich gezeigt werden. Daher müssen ungewollte pharmakologische Effekte oder zumindest das „Wegfangen“ des Inhibitors aufgrund dieser starken Wechselwirkung der Substanz mit der ubiquitär exprimierten CA2 in Betracht gezogen werden. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass durch eine Modifikation des Sulfonamidmotivs diese ungewollte Wechselwirkung, vermutlich aufgrund von sterischen Effekten, vollständig unterbunden werden kann. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Verwendung unterschiedlicher Immobilisierungsstrategien eine wertvolle Methodik darstellt, um neue und unbekannte off-targets von potentiellen Wirkstoffkandidaten zu identifizieren. Durch die erfolgreiche Anwendung dieser Methodik auf den Proteinkinase- Inhibitor C1 wurden verschiedene off-targets identifiziert, die mit unterschiedlichen Substanzmotiven wechselwirken. Die Methodik unterschiedlicher Immobilisierungsstrategien erscheint ebenfalls geeignet, um Zielproteine von Substanzen zu identifizieren, die in phänotypischen Screens in zell-basierten Assays oder Tierstudien gefunden wurden und deren Wirkmechanismen noch unbekannt sind.