Das Interleukin-10- (IL-10-) homologe Gen des equinen Herpesvirus Typ 2 (EHV-2): Untersuchungen zur Bedeutung während der akuten und latenten EHV-2-Infektion unter besonderer Berücksichtigung der Expression in vitro und in vivo

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurden Untersuchungen zur Bedeutung des IL-10-homologen Gens von EHV-2 unter besonderer Berücksichtigung der Genexpression in vitro und in vivo sowie den Eigenschaften seiner Primärstruktur durchgeführt. Dabei sollte insbesondere geprüft werden, ob sich das EHV-2-IL-10 einer bestimmten Transkriptklasse zuordnen lässt, der Nachweis EHV-2-IL-10-spezifischer Transkripte in vivo mit einem definierten Infektions¬stadium zusammenhängt und die Primärstruktur des EHV-2-IL-10 Eigenschaften aufweist, die Rückschlüsse auf seine Funktionalität zulassen. Zur Untersuchung der EHV-2-IL-10-Expression wurde zunächst eine sensitive und für das EHV-2-IL-10 spezifische seminested RT-PCR etabliert. Mit dieser Methode konnten in einer permanenten equinen Zelllinie dermalen Ursprungs (ED- Zellen) nach in vitro Infektion mit dem EHV-2-Referenzstamm LK-4 schon ab 6 Stunden post infectionem (p. i.) EHV-2-IL-10-spezifische Transkripte detektiert werden. Die Expression des EHV-2-IL-10-Gens war dabei schon vor den Transkripten des sehr frühen EHV-2-ORF-50 und des frühen-späten EHV-2-Glykoprotein B (gB) nachweisbar. Ferner konnte durch die Anwendung von Inhibitoren der Proteinsynthese sowie der viralen DNA-Replikation gezeigt werden, dass die Expression des EHV-2-IL-10 sowohl von der Proteinsynthese als auch von der viralen DNA-Replikation unabhängig erfolgt. Daher entspricht die Kinetik der Expression des EHV-2-IL-10 in dem untersuchten in vitro Modell den sehr frühen Genen der Herpesviren. Zum Nachweis einer EHV-2-IL-10-Expression in vivo wurden Blutproben von 3 natürlich mit EHV-2 infizierten Pferden über den Zeitraum von einem Jahr im monatlichen Abstand untersucht. Parallel wurde der EHV-2-Infektionsstatus dieser Pferde ermittelt. Durch serologische Untersuchungen ergaben sich dabei zwar Hinweise für das Vorliegen einer akuten EHV-2-Infektion, mit der RT-PCR zum Nachweis von ORF-50- und gB-Transkripten als Marker für die Virusreplikation sowie durch die Virusanzucht aus lysierten Zellen konnte jedoch keine akute EHV-2-Infektion in den mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC) der 3 Pferde detektierte werden. In den PBMC von 2 Pferden wurde mittels Kokultivierung latentes EHV-2 nachgewiesen, wobei sich die Anwendung von 12 O Tetradecanoylphorbol-13-Acetat (TPA) positiv auf die Reaktivierbarkeit des latenten Virus auswirkte. Untersuchungen mit der Gardella-Gel-Technik ergaben außerdem Hinweise für eine Integration von EHV-2-DNA in das Genom latent infizierter equiner PBMC. In den latent infizierten PBMC wurden bei 2 Pferden EHV-2-IL-10-spezifische Transkripte detektiert, während beim dritten Pferd trotz nachgewiesener latenter Infektion keine EHV-2-IL-10-Transkripte zu finden waren. Das EHV-2-IL-10 scheint demnach eine Rolle bei der latenten Infektion zu spielen. Die Frage nach der Möglichkeit, die Expression des EHV-2-IL 10 als Latenzmarker in der Diagnostik einzusetzen konnte jedoch nicht abschließend beantwortet werden. Mögliche Wirkungsmechanismen des EHV-2-IL-10 bei der latenten Infektion in equinen PBMC werden diskutiert und Wege zur weiterführenden Untersuchung dieser Ergebnisse aufgezeigt. Durch vergleichende Untersuchungen der Primärstruktur der EHV-2-IL-10-Proteine von 9 EHV-2-Referenzstämmen und -Feldisolaten wurde auf der Aminosäureebene ein hoher Konservierungsgrad von 96 % bis 100 % festgestellt. Ferner zeigte sich, dass die Amino¬säuresequenz des EHV-2-IL-10 mit dem IL-10-Protein des Pferdes zu 85 % übereinstimmt. Außerdem wurden durch die Erstellung eines Stammbaumes phylogenetische Analysen zum EHV-2-IL-10 und equinen IL-10 durchgeführt. Dabei wurde festgestellt, dass beide IL-10-Proteine einen hohen Homologiegrad aufweisen, was nahe legt, dass das EHV-2-IL-10 im Verlauf der Evolution direkt vom Pferd erworben wurde. Durch ein Aminosäuresequenz-alignment mit dem IL-10 des EBV, des Orf-Virus, des Menschen und des Schafes wurden funktionell bedeutsame Bereiche des EHV-2-IL-10 untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass Regionen, die bei zellulären IL-10-Proteinen immunstimulierende Funktionen ausüben, im EHV-2-IL-10 wie beim EBV-IL-10 nicht konserviert sind. Möglicherweise hat das EHV-2-IL-10 wie das EBV-IL-10 nur die immunsuppressiven Eigenschaften des Wirts-IL-10 konserviert, wodurch ein therapeutischer Einsatz des EHV-2-IL-10 bei immunpathologischen Erkrankungen des Pferdes denkbar wäre. Die Ergebnisse dieser Arbeit haben gezeigt, dass die etablierte EHV-2-IL-10-spezifische snRT- PCR zum sensitiven und spezifischen Nachweis von EHV-2-IL-10-Transkripten in vivo geeignet ist. Es bietet sich daher an, weiterführende Untersuchungen zur Rolle des EHV-2-IL-10 unter Verwendung dieser Methode durchzuführen. Die durch die computergestützten Sequenzvergleiche erhaltenen Hinweise für eine immunmodulatorische Wirkung des EHV-2-IL-10, sowie die möglicherweise existierenden Wirkungsunterschiede zum equinen IL-10, müssen durch funktionelle Studien in geeigneten Modellsystemen verifiziert werden.

The aim of this work was to analyse the EHV-2 IL-10 homologue gene with special consideration on its gene expression in vitro and in vivo as well as its primary structure. Thereby it should be clarified if the EHV-2 IL-10 is related to a certain transcript class, if it is connected to a defined stage of infection and if the primary structure of EHV-2 IL-10 allows conclusions to its function. The expression kinetics of the EHV-2 IL-10 gene were investigated by an EHV-2 IL-10 specific seminested RT-PCR following an in vitro infection of a permanent equine dermal cell line (ED-cells) with the EHV-2 reference strain LK-4. EHV-2 IL-10 specific transcripts were already detected 6 hours post infection (p. i.), even before the transcripts of the immediate early EHV-2 ORF-50 and early late EHV-2 Glykoprotein B appeared. Furthermore, the implementation of protein synthesis inhibitors as well as inhibitors of viral DNA replication showed that the expression of EHV-2 IL-10 occurred independently from the protein synthesis and also from viral DNA replication. Therefore the in vitro expression of the EHV-2 IL-10 was consistent with that of an immediate early herpes virus gene. For the analysis of the EHV-2 IL-10 expression in vivo, blood samples of three naturally with EHV-2 infected horses were examined monthly over a period of one year. Parallel the EHV-2 infection stage of the horses was determined. The results of serological analysis implied hints of an existing acute EHV-2 infection, but there was no evidence of productive virus replication in the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of all three horses either by RT PCR for EHV-2 ORF 50 and gB expression as markers for virus replication or by plaque assay for the detection of infectious virus in destroyed cells. From the PBMC of two horses latent EHV-2 was isolated by cocultivation, whereas the implementation of 12 O tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) had a positive effect on the reactivation of the latent virus. With the EHV-2 PCR positive PBMC of the third horse the cocultivation was always negative. Additionally Gardella gel analysis indicated that the DNA of latently infected equine PBMC contained integrated EHV 2 DNA. In the latently infected PBMC of two horses EHV-2 IL-10 specific transcripts were detected, whereas no EHV-2 IL 10 transcripts could be found in the PBMC of the third horse. The expression in latently infected PBMC suggests that the EHV-2 IL-10 takes part in the latent EHV-2 infection. However the question about the possible implementation of EHV 2 IL-10 transcripts as a diagnostic marker for the latent EHV-2 infection cannot be answered conclusively. Possible EHV-2 IL-10 functions in latently infected equine PBMC and ways of further examinations of these results will be discussed. Comparative studies of the EHV-2 IL-10 primary structure of 9 EHV-2 reference strains and field isolates revealed a high level of amino acid conservation of 96 % to 100 %. Moreover the EHV-2 IL-10 matches the equine IL-10 protein in 85 % of the amino acids. In addition phylogenetic analysis of EHV-2 IL-10 and equine IL-10 were conducted on basis of a developed phylogenetic tree. As a result both IL 10 proteins showed a high degree of homology, suggesting that the EHV-2 IL-10 was captured from the horse during evolution. An amino acid alignment with EBV, parapoxvirus orf, human and ovine IL-10 was carried out to identify candidate functional domains of EHV-2 IL-10. As a result regions were detected, which posses immune stimulating functions in the cellular IL-10 protein, that had not been preserved in the EHV-2 IL-10 as well as the EBV IL-10. Possibly EHV-2 IL-10, like EBV IL 10, preserved only the immunosuppressive qualities of the host IL-10, whereby a therapeutical implementation of the EHV-2 IL-10 would be conceivable with immunopathological diseases of the horse. In conclusion, the results of the current work show that the established EHV-2 IL-10 specific snRT-PCR is a sensitive and specific tool for the verification of EHV-2 IL-10 expression. This method presents an opportunity for further analysis of the role of the EHV 2 IL 10 in vivo. Indications for immunomodulatory effects and probably functional differences to the equine counterpart as observed by computer based sequence analysis, have to be verified by functional studies in adequate model systems.