SPON2 and its implication in epithelial-mesenchymal transition

Abstract

Epithelial-mesenchymal transition (EMT) describes a process of differentiation of epithelial cells into cells with mesenchymal properties. EMT is indispensable for normal development, including formation of mesoderm and neural crest, and the same mechanism is also abused by tumour cells to promote metastasis and generation of tumour derived supportive stroma. Analysis of a human small cell lung carcinoma cell line that exhibited simultaneous adherent and suspensive growth demonstrated a mesenchymal gene expression signature in the adherent fraction, which was absent from the suspensive subpopulation. In xenograft transplantation experiments it turned out that only the mesenchymal subpopulation was able to invade the host tissue. SPON2 was among the few differentially expressed genes in the two subpopulations, suggesting this gene as a cause or early consequence of EMT in this cell line. The few reports published till now describe SPON2 as an extra cellular matrix protein involved in axon guidance, immune response and adhesion. More recently it has also been reported as a prognostic marker for ovarian and prostate cancer. A fetal lung fibroblast cell line characterized by high SPON2 expression was chosen to broaden the understanding of the biological function of this protein. In interphase cells SPON2 was observed as fibrous meshwork in the cytoplasm and as distinct speckles within the nucleus. During mitosis and cytokinesis SPON2 expression was limited to the spindle apparatus and the midbody, respectively. The molecular consequences of transient siRNA knockdown were monitored at the RNA level. Genes deregulated by reduced levels of SPON2 were significantly enriched for Gene Ontology terms such as EMT, adhesion and motility. Pathway analysis indicated that these changes were likely to be mediated by triggering the TGF-beta signalling pathway. In silico prediction of potential disease association highlighted fibrosis, rheumatoid arthritis and tumour progression, all of which are known to be related to EMT. Co-immunoprecipitation followed by mass spectrometry significantly linked SPON2 to migration and the cytoskeleton, which nicely corroborated the results obtained by immunofluorescence. Both gene expression and co-immunoprecipitation data were subjected to network analysis. The vast majority of potential SPON2 interaction partners, as highlighted by these two independent experiments, were integrated in one comprehensive network indicating the plausibility of the results. In conclusion, data generated in this thesis suggest that SPON2 has an intracellular function, and that deregulation of this protein in tumour cells may enhance their metastatic capacity via EMT. Furthermore congenital or somatic mutations of SPON2 may be responsible for EMT associated late onset disorders including rheumatoid arthritis and fibrosis.

Der Prozess in dem Epithelzellen in Zellen mit mesenchymalen Eigenschaften übergehen wird allgemein als Epitheliale-Mesenchymale Transition (EMT) bezeichnet. EMT ist unerlässlich für normales Wachstum, einschließlich der Bildung des Mesoderms und der Neuralleiste, allerdings wird derselbe Mechanismus von Tumorzellen bei der Metastasenbildung und zur Entstehung von tumorösem Stroma missbraucht. Die Untersuchung einer humanen kleinzelligen Lungenkarzinomzelllinie, die gleichzeitig adhärentes und suspensives Wachstum zeigt, hat für die adhärierende Fraktion ein mesenchymales Genexpressionsmuster ergeben, dass sich bei der suspensiven Subpopulation nicht beobachten lässt. In Xenograftexperimenten zeigte sich, dassnur die mesenchymale Subpopulation zur Invasion des Wirtsgewebes fähig war.Genexpressionsanalysen beider Subpopulationen identifizierten SPON2 als eines der wenigen Gene mit unterschiedlicher Expressionshöhe, was darauf hinweist das SPON2 die Ursache oder eine frühe Folge von EMT für diese Zelllinie darstellt. Die wenigen bisher erschienenen Arbeiten beschreiben SPON2 als ein Protein der extrazellulären Matrix, das in die Axon Leitung/Zielfindung, die Immunantwort und die Adhäsion involviert ist. Jüngsten Berichten zufolge ist es auch prognostischer Marker für Ovarial- und Prostatakrebs. Eine fötale Lungenfibroblastenzelllinie, die sich durch hohe SPON2-Expression auszeichnet, wurde für das vertiefte Studium der biologischen Funktionen dieses Proteins ausgewählt. In der Interphase ließ sich SPON2 als fibröses Netzwerk im Zytoplasma und als wohlabgegrenzte Flecken im Zellkern beobachten. Während der Mitose und Zytokinese war die Lokalisation von SPON2 auf den Spindelapparat bzw. die Zellteilungsfurche beschränkt. Die molekularen Konsequenzen eines transienten siRNA-Knockdown wurden auf RNA-Ebene beobachtet. Gene die durch den Knockdown von SPON2 dereguliert wurden wiesen eine signifikante Anreicherung der „Gene Ontology“ Begriffen wie EMT, Adhäsion und Motilität auf. Signalwegsanalysen ließen vermuten, dass diese Veränderungen durch das Auslösen des TGF-beta Signalwegs vermittelt werden. In silico Vorhersagen möglicher Krankheitsassoziationen verwiesen auf Fibrose, rheumatoide Arthritis und Tumorprogression, von denen alle bekanntermaßen mit EMT zusammenhängen. Koimmunopräzipitation, gefolgt von Massenspektrometrie, stellte die Verbindung zwischen SPON2 zu Migration und Zytoskelett her, was die Ergebnisse der Immunofluoreszenzuntersuchungen noch zusätzlich bekräftigten. Die Datenkonvolute aus den Expressionsstudien und der Koimmunopräzipitation, wurden unabhängigen Netzwerkanalysen unterzogen durch welche potentielle Interaktionspartner von SPON2 identifiziert wurden. Die überwiegende Mehrheit der hierdurch identifizierten Interaktionspartner konnte im Anschluss in ein umfassendes Netzwerk integriert werden, welches die Plausibilität der Ergebnisse unterstreicht. Zusammenfassend deuten die Ergebnisse dieser Arbeit auf eine intrazelluläre Funktion von SPON2 hin, dessen Deregulation in Tumorzellen, deren metastatische Fähigkeit über EMT steigern kann. Darüberhinaus könnten erbliche oder somatische Mutationen von SPON2 für EMT-assoziierte, spät manifestierende Krankheiten wie rheumatoide Arthritis und Fibrosen verantwortlich sein.