Untersuchungen zur Funktion von Pex8p im peroxisomalen Matrixproteinimport der Hefe Saccharomyces cerevisiae

Abstract

Im Rahmen der in dieser Arbeit durchgeführten Two-Hybrid-Analysen wurden Pex7p, Pex14p und Pex8p als neue Interaktionspartner von Pex8p identifiziert. Interaktionen mit weiteren Peroxinen der Docking-Maschinerie, zu Peroxinen der Zinkfinger-Klasse und Peroxinen anderer Funktionskreise wurden nicht festgestellt. Der Interaktionsbereich zwischen Pex8p und Pex5p, Pex8p und Pex14p konnte auf die Aminosäuren 146-586 von Pex8p eingeengt werden. Der Interaktionsbereich zwischen Pex8p und Pex7p konnte nicht eingeengt werden. Pex7p benötigt zur Interaktion zu Pex8p das gesamte Pex8-Protein. Zur Interaktion mit Pex8p (146-586 aa) benötigt Pex5p die Aminosäuren 1-312. Die TPR-Domänen von Pex5p sind für die Interaktion zwischen Pex5p und Pex8p entbehrlich. Die Interaktion zwischen Pex8p und Pex14p wird sowohl von Peroxinen der Funktionskreise "Cargo-Rezeptor-Bindung", "Docking-Maschinerie" und "Rezeptor-Translokation" beeinflusst und ist daher indirekt. Die Interaktionen zwischen Pex8p und Pex5p sowie Pex8p und Pex7p werden durch kein Peroxin der untersuchten Funktionskreise vermittelt und scheinen daher direkt zu sein. Im Rahmen der Mutationsanalyse von Pex8p wurden drei Mutationen identifiziert, welche die Interaktion zwischen Pex8p und Pex5p, Pex7p und Pex14p auf unterschiedliche Weise unterbinden. Mutation Pex8pM-A(S231P) unterbindet die Interaktion zu Pex5p, Pex7p und Pex14p. Mutation Pex8pM-C(A238V) unterbindet die Interaktion zu Pex5p und Pex14p. Mutation Pex8pM-D(T327P) unterbindet die Interaktion zu Pex7p und Pex14p. Damit scheinen beide Rezeptoren für die Interaktion zwischen Pex8p und Pex14p notwendig zu sein. Die Pex8p-Deletionsmutante kann durch alle mutierten Pex8-Proteine komplementiert werden. Ebenfalls werden in diesen komplementierten pex8D-Zellen fluoreszenzmarkierte Cargoproteine in Peroxisomen importiert. Aufgrund der Mutationsanalysen von Pex8p ist es wahrscheinlich, dass Pex8p eine Lösung des Cargo-Rezeptor-Komplexes durch Konformationsänderung des Rezeptors bewirkt. Das Targeting von Pex8p zur peroxisomalen Membran in Abhängigkeit der PTS-Rezeptoren kann trotz der PTS- Signale innerhalb der Pex8p-Aminosäuresequenz ausgeschlossen werden. Dies wird durch Analysen zur Extrahierbarkeit des Proteins aus peroxisomalen Membranen unterstützt. Pex8p ist bei Abwesenheit von Pex5p für Proteinase K zugänglich. Somit beeinflußt Pex5p nicht das Targeting von Pex8p aber indirekt dessen Zugänglichkeit zu cytosolischen Komponenten.

In the course of this study Pex7p, Pex14p and Pex8p were identified as new interaction partners of Pex8p, by means of two-hybrid-analysis. Interactions of further peroxines of the docking-machinery, to peroxines of the zincfinger- class and of other functional groups were not identified. The region of interaction of Pex8p and Pex5p, Pex8p and Pex14p was narrowed down to amino acids 146-586 of Pex8p. It was not possible to narrow down the region of interaction of Pex8p to Pex7p. Pex7p needs a full length Pex8-protein for interaction. For interaction with Pex8p (146-586 aa) Pex5p requires the amino acids 1-312. The TRP-domains of Pex5p are not required for the interaction between Pex5p and Pex8p. The interaction between Pex8p and Pex14p is influenced by peroxines of the "cargo-receptor-binding-group", the "docking- machinery-group", and the "receptor-translocation-group", and is therefore indirect. The interactions between Pex8p and Pex5p, as well as between Pex8p and Pex7p are not mediated by peroxines of the investigated functional groups and are therefore likely to be direct. By means of mutationanalysis of Pex8p, three mutations were identified, which prevent interactions between Pex8p and Pex5p, Pex7p and Pex14p in different ways. Mutation Pex8pM-A(S231P) prevents the interaction to Pex5p, Pex7p and Pex14p. Mutation Pex8pM-C(A238V) prevents the interaction to Pex5p and Pex14p. Mutation Pex8pM-D(T327P) prevents the interaction to Pex7p and Pex14p. Therefore, both receptors seem to be necessary for interaction between Pex8p and Pex14p. The Pex8p-mutant can be complemented by all mutated Pex8-proteins. Moreover, fluorescently labelled cargoproteins are imported into peroxisomes in complemented pex8D-cells. On the basis of the mutationanalysis of Pex8p it is likely, that Pex8p induces the release of the cargo-receptorcomplex due to changes of the receptor conformation. In spite of the presence of a PTS-signal in Pex8p, the targeting of Pex8p to the peroxisomal membrane is independent of the PTS-receptors. This is further supported by extraction analysis of the protein from peroxisomal membranes. In the absence of Pex5p, Pex8p can be degraded by Proteinase K. Therefore Pex5p does not influence the targeting of Pex8p but indirectly influences its approachability to the cytosolic components.