Bioinert Polyglycerol Nano- and Microgels for the Encapsulation and Controlled Release of Proteins and Living Cells

Abstract

In this thesis a miniemulsion approach has been designed, which led to the synthesis of polyglyerol nanogels of dimensions previously unobtainable, providing simple access to materials in the nanoscale. Interestingly, these nanoparticles had a narrow size distribution and can be readily functionalized with a wide range of groups by click chemistry. The prepared nanogels were highly biocompatible and are therefore very promising for future applications as delivery vehicles for drugs and dyes. Owing to the size of these polyglycerol nanogels they rapidly and harmlessly internalized into cells by an endocytotic pathway. Additionally, the polyether miniemulsion chemistry has been expanded to biodegradable polyglycerol nanogels with promising transport properties for cellular delivery. A simple one step process was developed and conditions were tuned to vary particle size and nanogel composition. A variety of polyols and polyepoxides, which led to new functional materials, could be polymerized following our general procedure. These disulfide containing nanogels were degraded into small oligomeric subunits in reducing environments as shown by three different assays. Furthermore, disulfide containing polyglycerol nanogels were found to be the same biocompatibele as non- degradable polyglycerol based nanogels. These studies show that these materials are able to rapidly enter cells by endocytic mechanisms, thus entering the reductive intracellular environment. The developed epoxide cross- linking chemistry, however, requires high reaction temperatures, which are not suitable for the encapsulation of living cells and proteins during gel formation. Additionally, block-co-polymer surfactants were necessary which are difficult to be prepared on large-scale. Therefore, a gelation procedure was established which can be performed at room temperature and which allows for the stabilization of miniemulsion droplets by commercial surfactants. The use of a free-radical polymerization of acrylate functionalized polyglycerol macromonomers in miniemulsion droplets, initiated by APS/TEMED, yielded defined nanogels with a mean hydrodynamic diameter of 32 nm. By extension of this method to the use of micrometer-sized droplets, as obtained through microfluidic emulsification, monodisperse dPG microgels with uniform diameters of several tens or hundreds of micrometers were obtained. These microgels formed at polymerization conditions that can be used for the encapsulation of yeast cells. The reaction conditions in form of free radicals and high mechanical energy input by ultrasonication were still too harsh for the encapsulation of enzymes into nanogels and living cells into microgels. Therefore, a novel inverse nanoprecipitation method was developed to obtain enzyme-laden nanogels. Guests were encapsulated with an efficacy of almost 100 % and after drug release, full enzyme activity and structural integrity were retained. Surfactant free nanoparticle templation was performed and in situ crosslinking by copper catalyzed azide-alkyne cycloaddition of the precipitated nanoparticles resulted in size defined polyglycerol nanogels (100 - 1000 nm). Biodegradability was achieved by the introduction of benzacetal bonds into the net points of the nanogel. Interestingly, the polyglycerol nanogels quickly degraded into low molecular weight fragments at acidic pH values, which are present in inflamed and tumor tissues as well as intracellular organelles, and they remained stable at physiological pH values for a long time. This gelation chemistry, however, can not be applied for the encapsulation of living cells because of the cytotoxicity of the copper catalyst. Therefore, a new macromonomer construction kit has been designed that allows the bioorthogonal encapsulation of living mammalian cells by strain promoted azide-alkyne click chemistry into microgels. Additionally the encapsulated cells were released upon demand for the first time under acidic conditions. The encapsulated cells could be cultured inside the microgels with full retention of their viability. Microgel degradation was precisely controlled by different substituted benzacetals as pH-cleavable linkers on the dendritic building block and had no detrimental effect on the encapsulated and released cells. As a result, the microgel particles can be used for temporary cell encapsulation, allowing the cells to be studied and manipulated during the encapsulation and then isolated and harvested on demand by decomposition of the microgel scaffolds. Thus, our approach will advance the understanding of cellular survival in artificial 3D matrix environments. Additionally, our construction kit has potential for the stabilization and controlled release of many other therapeutic relevant biological systems such as proteins, genes, and even bacteria. In future the nanoprecipitation procedure presented in this work could be further investigated. Application of the bioorthogonal gelation chemistry for the nanogel formation might enable the encapsulation of even more sensitive therapeutic enzymes such as epo and somatostatin. Furthermore, the nanoprecipitation technique is well suited for a process up-scaling. This might be interesting for applications that require big material quantities. Additionally, more pH cleavable acetal linkers with varying cleavage kinetics could be synthesized to get an even higher control over degradation rates.

In dieser Arbeit wurden erstmalig Polyglycerinnanogele durch Polyadditions- vernetzungsreaktionen zwischen Glycerin und Glycerin-basiertem Polyepoxid in Miniemulsionströpfchen hergestellt. Durch die Reaktion von nicht umgesetzten Epoxidgruppen mit Natriumazid konnten diese Nanogele durch Kupfer-katalysierte Azid-Alkin Zykloaddition mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert werden um die Zellaufnahme der Nanogele zu verfolgen. Interessanterweise wurde festgestellt, dass Nanogele mit einem Durchmesser von 50 nm schnell und effizient in Tumorzellen mittels Endozytose aufgenommen wurden. Kleine Polyglycerindendrimere mit einem Durchmesser von etwa einem Nanometer wiesen nur eine geringe Zellaufnahme auf. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die Größe der Nanogele einen entscheidenden Einfluss auf die Zellaufnahme hat und somit ein wichtiger Parameter für die intrazelluläre Freisetzung von Wirkstoffen darstellt. Desweiteren konnte dieser Ansatz zur Herstellung von bioabbaubaren Nanogelen verwendet werden, welche Disulfidbrücken im Nanogelnetzwerk aufwiesen. Mittels mehrerer Charakterisierungsmethoden konnte gezeigt werden, dass die Nanogele unter reduktiven Bedingungen, welche in intrazellulären Umgebungen vorliegen, in kleine oligomere Bausteine gespalten werden. Durch diesen Abbau können Wirkstoffe intrazellulär freigesetzt und die zytokompatiblen Abbauprodukte können letztenendes aufgrund ihrer geringen Größe durch die Nieren wieder ausgeschieden werden. Obwohl diese Herstellungsmethode vielversprechende Ergebnisse lieferte, können aufgrund der hohen Reaktionstemperaturen keine therapeutischen Proteine in die Nanogele verkapselt werden. Diese neuartigen Therapeutika wären jedoch für zukünftige Therapieansätze sehr vielversprechend. Daher wurde die Polyadditionschemie durch die freie radikalische Vernetzung von Acrylat-funktionalisierten Polyglycerinen ersetzt, welche bei Raumtemperatur vernetzen. Hierdurch wurden erstmalig Polyglycerin-Nano- und Polyglycerin-Mikropartikel durch die Gelierung in Miniemulsions- und mikrofluidischen Tröpfchen hergestellt. Bemerkenswerterweise konnte die Gelierung der Mikrotröpfchen in Anwesenheit von Hefezellen durchgeführt werden, wodurch die Zellen in den Mikrogelen mit einer Zellüberlebensrate von 40% verkapselt wurden. Allerdings stellte sich die freie radikalische Vernetzungsreaktion als zu zelltoxisch heraus und die Anwendung von energiereicher Ultraschallbehandlung zur Miniemulgierung würde zu Proteindenaturierungen führen. Demzufolge wurde in dieser Arbeit eine neuartige inverse Nanofällungsmethode entwickelt um enzymbeladene Nanogele unter milden Bedingungen herzustellen. Hierbei konnten die Gäste mit einer Beladungseffizienz von beinahe 100% verkapselt werden und nach pH- kontrollierter Freisetzung wurde eine vollständige Enzymaktivität festgestellt. Die Nanopartikelherstellung konnte ohne Verwendung von Tensiden durchgeführt werden, wodurch Proteindenaturierungen vermieden wurden. Interessanterweise bauten sich die Nanogele bei niederen pH-Werten, welche in intrazellulären Umgebungen vorliegen, schnell durch Hydrolyse ab. Da die Nanogele bei physiologischem pH-Wert von 7,4 über einen langen Zeitraum stabil blieben, sind diese Systeme bestens für die kontrollierte intrazelluläre Wirkstofffreisetzung geeignet. Die Azid-Alkin Vernetzungschemie ist allerdings für in-vivo-Anwendungen kritisch, da verwendete Kupferkatalysatoren toxische Wirkungen hervorrufen können. Deshalb wurde in dieser Arbeit ein Makromonomerbaukasten für die bioorthogonale Verkapselung und pH-gesteuerte Freisetzung von lebenden Zellen entwickelt. pH-Spaltbare zellbeladene Mikrogele mit exzellenten Langzeitüberlebensraten wurden durch Kombination bioorthogonaler spannungsvermittelter Azid-Alkin-Cycloaddition (SPAAC) und Tröpfchen-basierter Mikrofluidik hergestellt. Poly(ethylenglykol)dicyclooctin und dendritisches Poly(glycerinazid) dienten als bioinerte Mikrogelbausteine. Die Azid-Konjugation erfolgte mithilfe unterschiedlicher säurelabiler Benzacetallinker, wodurch eine präzise Steuerung der Abbaukinetik im interessanten pH-Bereich zwischen 4,5 und 7,4 ermöglicht wurde. Hierdurch konnte eine pH-gesteuerte Freisetzung der verkapselten Zellen auf Abruf erreicht werden, ohne ihre Überlebensrate oder Ausspreizung zu beeinträchtigen. Folglich können die Mikrogelpartikel für die temporäre Verkapselung von Zellen verwendet werden, wobei sich die Zellen während der Verkapselung studieren und manipulieren lassen. Anschließend können die Zellen durch Zersetzung des Mikrogelgerüstes isoliert und freigesetzt werden.