Prüfung und Etablierung stereologischer Methoden zur Quantifizierung histomorphologischer Strukturen in experimentellen Tumoren

Abstract

In dieser Arbeit wurden stereologische Methoden zur mikroskopischen Quantifizierung dreidimensionaler Strukturen von Tumoren getestet und etabliert. Hierfür wurde zunächst der Richtungsverlauf tumoraler Blutgefäße untersucht. Es konnte festgestellt werden, dass experimentelle, unbehandelte Tumore ein isotropes Blutgefäßnetz besitzen. Dies bedeutete für die stereologische Untersuchung dieser tumoralen Blutgefäße, dass auf die Anfertigung sogenannter isotropic uniform random Schnitte verzichtet werden konnte. Anschliessend wurde der Einfluss der histologischen Aufarbeitung der Tumore auf deren Schrumpfung bzw. Deformation, die die quantitative mikroskopische Analyse in dieser Arbeit beeinflussen könnte, untersucht. Es konnte festgestellt werden, dass die Deformation der Gefrierschnittfläche hauptsächlich auf mechanischen, technischen und praktischen Einflüssen beruhte. Die Schrumpfungsprozesse der Tumorgefrierschnitte wirkten sich jedoch nur minimal auf die stereologischen Ergebnisse in dieser Arbeit aus, so dass diese in ihrer Aussagekraft nicht beeinträchtigt wurden. Dann wurde anhand der tumoralen Blutgefäßquantifizierung die Reproduzierbarkeit der stereologischen Methode und der klassischen MVD (microvessel density) Methode nach Weidner ermittelt und beide Methoden miteinander verglichen. Die stereologische Methode lieferte deutlich reproduzierbarere Ergebnisse. Abschließend wurden histomorphologische Strukturen (intaktes und nekrotisches Tumorvolumen, tumorale Blutgefäßlänge) in experimentellen Pankreaskarzinomen mittels stereologischer Methoden in vitro ausgewertet. Diese Resultate wurden mit vorher erhobenen in vivo Daten korreliert. Hierfür wurden tumortragende Mäuse in zwei Gruppen eingeteilt, wobei die erste Gruppe mit dem unspezifischen Kontrastmittel TSC und die zweite Gruppe mit dem gefäßspezifischen Kontrastmittel AP39-TSC behandelt wurde. Die Tumorsignalintensitäten wurden mittels NIR (Nah-Infrarot) Laser ermittelt. Anschließend wurden die gesamte Tumorgefäßlänge und die Volumina der nekrotischen und intakten Tumorbereiche jedes Tumors mikroskopisch mittels stereologischer Methoden in vitro quantifiziert. Die histologischen Resultate wurden dann mit den in vivo Daten korreliert. Die Laser-induzierte Fluoreszenzsignalintensität war stärker nach der AP39-TSC- (Ø Tumorkontrast 6,5) als nach der TSC-Kontrastmittelgabe (Ø Tumorkontrast 1,1). Es konnte für das spezifische Kontrastmittel (AP39-TSC) eine siginifikante, positive Korrelation zwischen den Tumorkontrastwerten und den stereologischen Werten des intakten Tumorvolumens und der Blutgefäßlänge ermittelt werden. Es bestand aber keine Korrelation zwischen den nekrotischen Tumorregionen und diesen Kontrastwerten. Die Kontrastwerte des unspezifischen Kontrastmittels (TSC) korrelierten weder mit den intakten Tumorvolumina noch mit den tumoralen Blutgefäßlängen. Es konnte jedoch eine signifikante, positive Korrelation zwischen den unspezifischen Kontrastwerten und den nekrotischen Tumorvolumina festgestellt werden. Es konnte somit nachgewiesen werden, dass sich das Kontrastmittel AP39-TSC spezifisch in den tumoralen Blutgefäßen anreicherte, das Kontrastmittel TSC dagegen nicht. Das unspezifische TSC reicherte sich bevorzugt in den nekrotischen Bereichen der Tumore an. Die quantitative Mikroskopie unter der Verwendung stereologischer Methoden bietet aussagekräftige, objektive und reproduzierbare Daten über dreidimensionale tumorale Strukturen und bietet daher neue Möglichkeiten zur pharmakologischen Charakterisierung diagnostischer und therapeutischer Substanzen.

In this doctoral thesis, stereological methods were testet and established for the microscopic quantitation of three-dimensional tumoral structures. First, the orientation of tumoral blood vessels was analyzed. The result was that experimental, untreated tumors have isotropic blood vessels. That means for the stereological investigations that so called isotropic uniform random sections do not have to be produced. Second, the deformation and shrinkage of histological cryostat sections of tumors during the histological process were proofed, because these factors can contribute to systematic errors in stereological results. The deformation and shrinkage of the sections were mainly based on mechanical, technical and practical manipulation. However, the deformation and shrinkage of the tumor sections were so little, that they will not influence the significance of the stereological results in this study. Third, the reproducibility of a stereological method was proofed and compared to a classical method. Therefore tumoral blood vessels were quantified by using stereological tools and by using the classical microvessel density (MVD) method of Weidner. The stereological method provided more objective and reproducible results compared to the MVD method. Finally, histomorphological structures (intact and necrotic tumor volume, tumoral blood vessel length) of experimental pancreatic carcinoma were analyzed via stereological methods. Those results were compared to in vivo data, which were established before. For the in vivo study, the human pancreatic NET-cell line BON was implanted orthotopically into immune deficient mice. The specific NIR-dye was intravenously administered to the first group of tumor bearing rodents (n=22), the unspecific NIR-dye to the second group (n=17). The laser induced fluorescence signal intensity was stronger after application of the specific NIR-dye (Ø tumor contrast 6.5) compared to the unspecific dye (Ø tumor contrast 1.1). For the specific NIR-dye a significant correlation between the tumor signal intensity and both the total volume of vital tissue and the total blood vessel length of each tumor could be demonstrated. No correlation between the tumor signal intensity of the specific dye and the volume of necrotic tumor masses was found. In contrast, a significant correlation between the tumor signal intensity induced by the unspecific dye and the volume of necrotic tumor masses was detected. These tumor fluorescence intensities did neither correlate with the volume of vital tumor tissue nor with the total blood vessel length. This study demonstrated that the contrast agent AP39-TSC accumulated specifically within the tumoral blood vessels. In contrast, the unspecific TSC accumulated mainly in the necrotic tumor regions. Quantitative microscopy using stereological methods provides meaningful and objective estimations of three-dimensional structures and offers new possibilities for the pharmacological characterization of diagnostic and therapeutic substances in different indications.