Novel insights into Flt1 mediated sprouting angiogenesis in zebrafish

Abstract

In vertebrates, the formation of blood vessels is fundamental for development, tissue growth and repair. New blood vessels are formed from pre-existing vessels in a process termed sprouting angiogenesis. Endothelial cells with distinct cell fates and behaviour guide the angiogenic sprouts. The leading endothelial cell, called tip cell, extends filopodia protrusions to explore the local environment for guidance cues such as vascular endothelial growth factor (VEGF), while the adjacent stalk cell is responsible for lumen formation. VEGF mediates its signal through binding to its cognate receptors VEGFR-1 and -2 that are expressed on tip and stalk cells. Several studies have linked the expression levels of VEGFR-1, also called Flt1, with the capacity to form new vessels in pathologies like ischemic cardiovascular diseases, retinopathies and tumour growth. However, the precise function of Flt1 during sprouting angiogenesis is unknown. Using transgenic zebrafish embryos as model system, we aimed to characterize the role of Flt1 during vascular growth in vivo. Here we show that Flt1 negatively regulates tip cell formation. Initial analysis of Flt1 in zebrafish revealed expression of membrane-bound Flt1 (mFlt1) and a so far unknown soluble isoform of Flt1 (sFlt1). Knockdown of Flt1 in zebrafish embryos increased tip cell behaviour within the angiogenic sprout resulting in hyperbranching of segmental arteries. In line with increased sprouting, we observed a reduced expression of the Notch signalling pathway; a signalling casacade that suppresses tip cell differentiation. Conditional overexpression of Notch in Flt1 deficient embryos could restore the segmental artery pattering indicating a contribution of Notch to the vascular phenotype. In addition to the vascular expression domain of Flt1, we detected Flt1 expression in neurons of zebrafish embryos. Knockdown of Flt1 resulted not only in aberrant vessels but also in a reduced neuronal cell number, pointing to a role of Flt1 also in developing neurons. Surprisingly, vascular specific overexpression of the secreted isoform sFlt1 led to a distribution throughout the neural tube. This suggests that the nervous system may contribute to establishing VEGF gradients required for segmental artery outgrowth. These results demonstrate that Flt1 acts in a Notch dependent manner as negative regulator for tip cell formation and branching morphogenesis. Moreover, Flt1 affects neurogenesis and can most likely function at the interface of vascular and neuronal development.

Die Bildung von Blutgefäßen ist essentiell für die Entwicklung, das Wachstum und die Regeneration von Gewebe in Vertebraten. Neue Blutgefäße können durch den Prozess der Angiogenese aus bereits bestehenden Gefäßen entstehen. Die Endothelialzellen im Gefäßspross besitzen abhängig von ihrer Lokalisation unterschiedliche Eigenschaften. Die an der Spitze des Gefäßsprosses liegende Endothelialzelle wird als „tip cell“ bezeichnet. Diese erkennt mithilfe von Filopodien die Umgebung nach vaskulären Wachstumsfaktoren, wie z.B. VEGF („vascular endothelial growth factor“) und bestimmt somit die Wachstumsrichtung des Gefäßsprosses. Die angrenzende Endothelialzelle, die „stalk cell“, dient der Lumenbildung. VEGF vermittelt sein Signal durch die Bindung an die VEGF-Rezeptoren-1 und -2, welche auf der „tip cell“ und der „stalk cell“ lokalisiert sind. Verschiedene Studien belegen einen Zusammenhang zwischen der Expression des VEGF-Rezeptors-1 (Flt1) und der Pathologie von Herz-Kreislauferkrankungen, der Ausbreitung von Tumoren und Retinopathien. Die genaue Funktion von Flt1 in Gefäßen und ihrer Enstehung ist jedoch weitgehend unbekannt. Zur Charakterisierung der Rolle von Flt1 während der Angiogenese in vivo, wählten wir transgene Zebrafischembryonen als Modellsystem. In dieser Arbeit wurde Flt1 als negativer Regulator bei der Bildung von „tip cells“ identifiziert. Erste Untersuchungen im Zebrafischembryo ergaben die Expression einer membrangebundenen Flt1 Isoform (mFlt1) und einer bisher nicht annotierten löslichen Isoform von Flt1 (sFlt1). Die Depletion von Flt1 im Zebrafischembryo zeigte eine vermehrte Bildung von „tip cells“ im angiogenen Gefäßsproß. Dies führte während der Entwicklung zu einem verstärkten Verzweigungsmuster der intersomitischen Gefäße. Konsistent zu diesem Phänotyp wurde in diesen Zebrafischembryonen eine reduzierte Expression des Notch- Signalweges beobachtet, eine Signalkaskade, die die „tip cell“ Differenzierung steuert. Die konditionelle Überexpression von Notch in Flt1-defizienten Zebrafischembryonen verringerte signifikant die aberranten Gefäßverzweigungen und deutet auf eine Beteiligung von Notch im vaskulären Phänotyp von Flt1 an. Zusätzlich zu der vaskulären Expression von Flt1, wurde eine Expression in Neuronen detektiert. Neben aberranten Gefäßen resultierte die Depletion von Flt1 in einer reduzierten Anzahl an Neuronen. Interessanterweise führte eine gefäßspezifische Überexpression der löslichen Isoform sFlt1 zu einer Distribution im Neuralrohr. Eine Beteiligung des Nervensystems bei der Etablierung des VEGF Gradienten, welcher für das Wachstum der intersomitischen Gefäße essentiell ist, wäre daher möglich. Die Ergebnisse der vorliegenden Untersuchungen zeigen, dass Flt1 in Abhängigkeit von Notch die Bildung von „tip cells“ und die arterielle Gefäßmorphologie negativ reguliert. Darüber hinaus verringert Flt1 die Anzahl der Neuronen und agiert wahrscheinlich an der Schnittstelle der Gefäß- und Nervenentwicklung.