Entwicklung und funktionelle Analyse eines zellbasierten Bioaktivitätstests für das Immunzytokin L19-IL2

Abstract

Gegenwärtig befinden sich viele biopharmazeutische Präparate wie beispielsweise Immunzytokine in der Forschungs- und Entwicklungspipeline pharmazeutischer Unternehmen. Immunzytokine sind bifunktionale Proteine, die aus einem spezifischen Antikörperanteil sowie einem konjugierten Zytokin bestehen. L19-IL2 stellt ein vielversprechendes Immunzytokin für die Krebstherapie dar und befindet sich derzeit in der klinischen Erprobung. Dieses Protein besteht aus dem humanen scFv Antikörperfragment L19, das spezifisch einen Tumor-assoziierten Bestandteil der extrazellulären Matrix bindet, und humanem Interleukin 2 (IL2), welches zur Stimulation der Immunabwehr in unmittelbarer Umgebung des Tumors führen soll. In der vorliegenden Arbeit wurde L19-IL2 mit unterschiedlichen, bioanalytischen Methoden charakterisiert. Das Ziel bestand dabei in der Entwicklung eines neuen zellbasierten Bioaktivitätstests, der beide funktionellen Anteile des Immunzytokins berücksichtigt und die aktuellen Anforderungen internationaler Arzneimittel-zulassungsbehörden wie der European Medicines Agency (EMA) oder der US Food and Drug Administration (FDA) erfüllt. Die Ausgangsbasis für die neue Methode bildete ein klassischer, zellbasierter IL2 Bioaktivitätstest, mit dem ausschließlich die biologische Aktivität des konjugierten IL2 gemessen werden kann. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde darauf aufbauend ein neuer Bioaktivitätstest für L19-IL2 entwickelt, mit dem gleichzeitig die Aktivität des L19 scFv-Anteils und die Fähigkeit des IL2-Anteils, die Proliferation der IL2 abhängigen, zytotoxischen T-Zelllinie CTLL-2 zu induzieren, bestimmt werden kann. Durch die Validierung des neuen Testformats wurde gezeigt, dass der Test für die Aktivitätsbestimmung von L19-IL2 geeignet ist und eine deutliche Verbesserung verglichen zu anderen Methoden darstellt, die jeweils auf die Analyse einer funktionellen Einheit des Immunzytokins beschränkt sind. Der Vergleich des neu entwickelten L19-IL2 Bioaktivitätstests mit dem klassischen IL2 Bioaktivitätstest zeigte, dass die Immobilisierung von L19-IL2 durch die Bindung an sein Antigen zu einer verminderten IL2 vermittelten Aktivität im Vergleich zu freiem L19-IL2 führte. Eine Hypothese für die Ursache dafür besteht in der verminderten Induktion der IL2-Signalkaskade aufgrund fehlender oder reduzierter Internalisierung des IL2 Rezeptorkomplexes. Daher wurden die Auswirkungen der Immobilisierung von L19-IL2 auf die Bindung an den IL2-Rezeptor (IL2-R), die Signaltransduktion und die zeitabhängige Internalisierung des IL2 Rezeptorkomplexes mittels Western Blot und konfokaler Laserscanning Mikroskopie (CLSM) untersucht. Der Nachweis von phosphoryliertem STAT5 zeigte, dass auch immobilisiertes L19-IL2 den JAK-STAT Signalweg induziert. Die CLSM-Studien ergaben jedoch, dass die Immobilisierung von L19-IL2 tatsächlich zu einer verringerten Internalisierung führte und unterstützten damit die Hypothese.

Immunocytokines represent a remarkable portion of cancer-directed biological medicinal development candidates, which are currently under investigation in the pharmaceutical R&D; pipelines. These bifunctional molecules consist of a specific targeting antibody-based portion and a linked cytokine. The immunocytokine L19-IL2, which is currently under clinical investigation, is a promising candidate in cancer therapy. This protein comprises the human scFv antibody fragment L19, which is specific for a antigen expressed in the extracellular matrix surrounding tumor vasculature and human interleukin 2 (IL2), which stimulates the immune system in the tumor microenvironment. In this PhD thesis L19-IL2 was characterized by a broad spectrum of bioanalytical methods. The aim was to develop new a cell-based potency assay for L19-IL2, which enables the evaluation of both functional moieties and fulfills the requirements for potency assays requested by regulatory authorities like the European Medicines Agency (EMA) or the US Food and Drug Administration (FDA). The basis for the new method was a conventional IL2 potency assay format, which measures only the biological activity of the conjugated IL2. This assay format was modified in order to allow the combined analysis of specific L19 binding capacity and the ability of IL2 to induce proliferation of the detector cytotoxic T-cell line CTLL-2. Validation of the new test format showed that this assay is suitable for potency estimation of the immunocytokine L19-IL2 and represents a major improvement compared to other approaches, which are limited to the evaluation of only one functional moiety of the immunocytokine. The comparison of the newly designed potency assay for L19-IL2 with the conventional IL2 potency assay format revealed that the immobilization of L19-IL2 via antigen binding led to a lower IL2-mediated activity compared to unbound L19-IL2. One hypothesis for this observation is the reduced induction of the IL2 signaling pathway due to reduced or lack of internalization of the IL2 receptor complex. To check this hypothesis, the influence of L19-IL2 immobilization on IL2-receptor binding, signal transduction and time-dependent internalization of the IL2 receptor complex was investigated by western blot and confocal laser scanning microscopy (CLSM). The detection of phosphorylated STAT5 via western blot showed that immobilized L19-IL2 as well as unbound L19-IL2 induced the JAK-STAT signaling pathway. However, the CLSM studies showed that immobilization of L19-IL2 led to a lower internalization, thus supporting the hypothesis.