Untersuchung der Variabilität eines Glykoproteins und eines G Protein- gekoppelten Rezeptors (UL55, UL33) von Zytomegalie-Viren

Abstract

Zytomegalie-Viren (HCMV) sind Krankheitserreger, die im Menschen lebenslang persistieren und eine Vielzahl von klinischen Manifestationen verursachen können, welche insbesondere bei immunsupprimierten Patienten auftreten. Vergleiche klinischer HCMV-Isolate zeigen multiple polymorphe Genbereiche, eine Serotypeneinteilung existiert bisher jedoch nicht. Die Versuche verschiedener Autoren, Zusammenhänge zwischen dem klinischem Ablauf einer HCMV-Infektion und bestimmten Genotypen einzelner Genbereiche festzustellen, führten bisher lediglich zu einer widersprüchlichen Studienlage, ohne unmittelbare Praxisrelevanz. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine PCR- basierte Methodik zu entwickeln, die in klinischem Probenmaterial zusätzlich auch hochdivergente Genotypen und mehrere Genotypen in einer Probe nachweisen kann. Die Entwicklung und Evaluation der Methodik erfolgte an Glykoprotein B (gB). Nachfolgend wurde die Polymorphie von UL33, einem CMV-kodierten G -Protein-gekoppelten Rezeptor, untersucht. Dafür wurden degenerierte nested- PCR-Systeme entwickelt, die hochsensitiv (≤10 Kopien / µl) einen Bereich um die Schnittstelle von gB beziehungsweise das gesamte UL33-Gen amplifizieren können. An Primaten-CMV (aus Schimpansen und Gorillas) konnte durch Amplifikation teilweise bisher unbekannter gB- und UL33-Sequenzen die Vielseitigkeit beider degenerierter nested-Primersysteme bestätigt werden. Bei Untersuchungen mischinfizierter Proben mit degenerierten Primern wird, abhängig von Viruslast und Primeraffinität, vorwiegend ein Genotyp amplifiziert. Andere vorkommende Genotypen werden hingegen nicht detektiert. Um diese nicht detektierten Genotypen nachzuweisen, wurde der erstdetektierte Genotyp durch antisense-Oligonukleotide von der Amplifikation ausgeschlossen. Hierbei kamen als Nukleinsäure-Analoga locked-nucleic-acid Oligonukleotide (LNA) zum Einsatz. Es konnte gezeigt werden, dass – im Gegensatz zu Vermutungen anderer Autoren – LNA von mehr als 12 Basenpaaren Länge als spezifische antisense-Oligonukleotide dienen können. So erlaubten die für die vier gB-Genotypen synthetisierten LNA die spezifische Amplifikation eines unterrepräsentierten gB-Genotypen aus einer artifiziell vierfach mischinfizierten Probe. Nachfolgend konnten die HCMV aus 30 Proben immunsupprimierter Patienten genotypisiert werden. Hierbei ergaben sich Hinweise darauf, dass der Anteil gB-mehrfachinfizierter Immunsupprimierter höher ist, als derzeit vermutet. Folgende Bezeichnungen von UL33-Genotypen wurden vorgenommen: Stamm Merlin als UL33-1, Stamm Toledo als UL33-2 und Stamm AD169 als UL33-3. Genotyp UL33 4 konnte erstmals in dieser Arbeit nachgewiesen werden. Die Sequenzanalyse des putativen, gespleißten Proteinprodukts zeigte den neuen Genotypen als divergentesten mit größter Ähnlichkeit zu UL33-1 mit 94% Übereinstimmung auf Aminosäureebene. In der Gruppe der immunsupprimierten Patientenproben wurden die UL33-Genotypen 1-3 mit abnehmender Häufigkeit nachgewiesen. Insgesamt 30% der Proben zeigten HCMV-Infektionen mit mehreren UL33-Genotypen. Vergleiche der Sequenzvariabilität mit Strukturberechnungen des UL33-Rezeptors lassen eine Variabilität vor allem der extrazellulären Rezeptoranteile vermuten. Daher sollten zukünftige Studien zum Nachweis des natürlichen Liganden von UL33 unter anderem auch mit UL33-1 erfolgen. Die UL33 -nested-PCR und die zugehörigen LNA ermöglichten die Amplifikation des kompletten UL33-Gens mit allen seinen genotypischen Varianten. Die in dieser Arbeit entwickelte Methodik erlaubt den Nachweis bisher unbekannter hochdivergenter CMV-Genotypen und zeigt erstmals die Funktionalität von reinen LNA als inhibierende antisense-Oligonukleotide in degenerierten PCR.

Cytomegalovirus infections can cause serious problems in fetus, newborns and immunocompromised patients, and viral DNA is usually detected with specific PCR. An unprejudiced way of analysing human samples for the presence of known and unknown cytomegalovirus genotypes is to use degenerate primers. However, in mixed infections, only one dominant genotype is usually amplified. Here, we present a modification of degenerate nested PCR by utilizing oligonucleotides of locked nucleic acids (LNA) to specifically block the genotype sequence which is preferentially amplified in the PCR reaction. This technology was used to detect and differentiate genotypic variants of the glycoprotein B gene (UL55) and a G-protein-coupled receptor gene (UL33) of human cytomegalovirus (HCMV). Two nested degenerate primer pairs were designed which broadly amplified hominoid CMV (from men and chimpanzees). With the help of UL55- and UL33-specific LNA, a collection of clinical samples was differentially screened for the occurrence of multiple infections with HCMV genotypes. The five gB and the three UL33 genotypic variants known to date were identified, and a novel fourth UL33 genotype was discovered.