Expression und Funktionalität von NOD1 und NOD2 in murinen Präadipozyten des mesenterialen Fetts

Abstract

Die Hypertrophie des mesenterialen Fetts um entzündete Darmabschnitte bei Morbus Crohn ist ein oft beobachteter und zugleich unverstandener Befund. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung des immunologischen Repertoires von Vorläuferzellen des mesenterialen Fetts und fokussierte sich auf die zytosolischen Pattern Regognition-Rezeptoren Nucleotide Oligomerization- binding Domain (NOD)-Proteine 1 und des mit der Pathogenese des Morbus Crohn assoziierten NOD2. Die basale Expression von NOD1 in murinen Präadipozyten war auf Transkriptebene mit der aus Vorläuferzellen generierten Makrophagen vergleichbar, während die Expression von NOD2 deutlich schwächer ausgeprägt war. Auf Proteinebene ließen sich sowohl NOD1 als auch NOD2 in Lysaten muriner Präadipozyten mittels Western Blot darstellen. Die Expression insbesondere von NOD2 konnte zum einen durch Nachahmung eines proinflammatorischen Milieus mit rekombinanten Zytokinen, zum anderen durch Stimulation mit bakteriellen Abbauprodukte, wie sie im Zuge der bakteriellen Translokation im mesenterialen Fett zu finden sind, moduliert werden. Funktionelle Studien an murinen Präadipozyten zeigten eine signifikante Produktion von IL-6 in Reaktion auf den NOD1-spezifischen Liganden Laktyl-tetra-Diaminopimelinsäure (LT-DAP) und diese konnte als Nukleärer Faktor (NF)κB-abhängig charakterisiert werden. Die Transfektion von eukaryontischen Zellen stellte in der vorliegenden Arbeit eine unverzichtbare Methode für die funktionelle Studien dar, weswegen ein neuartiges Elektroporationssystem in Eigenregie geplant und gebaut wurde, dass es dem Anwender erlaubt, für die physiologischen Eigenschaften der zu transfizierenden Zellen optimale elektrische Parameter wählen zu können. Mit dem ELPorator 1000-System war eine hocheffiziente Transfektion sowohl von adhärenten Zellen als auch von Suspensionszellen durch die umterbrechungsfreie Kombination eines kurzen (µs) High Voltage (HV)-Impulses mit einem längeren (ms) Low Voltage (LV)-Impuls möglich. Während ein HV-Impuls hauptsächlich für die absolute Anzahl transfizierter Zellen verantwortlich war, ermöglichte ein nachfolgender LV-Impuls die Modulation der Expressionshöhe der eingeschleusten Nukleinsäure. Die Spezifität des NOD1-spezifischen Liganden LT-DAP wurde so anhand von NOD1-Knock-down Studien mittels spezifischer Small Interfering (si)RNA gezeigt. Die direkte molekulare Interaktion von NOD2 mit MDP ist in der Literatur bis heute nicht gezeigt, weshalb ein Testsystem etabliert wurde, mit dem eine Charakterisierung dieser Interaktion anhand der Oberflächen- Plasmon-Resonanz-Spektroskopie möglich wurde. Hierfür erforderliches rekombinantes NOD2 wurde als Fusionsprotein mit Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP)-Tag in eukaryontischen Zellen exprimiert. Eine Immobilisation auf dem Sensorchip erfolgte mittels eines anti-EGFP-Antikörpers. Die Ergebnisse dieser Studien bestätigten die postulierte Bindung von MDP durch NOD2. Es konnte ferner gezeigt werden, dass nicht nur MDP in seiner spiegelisomeren LD-Form gebunden wird, sondern auch in seiner unwirksamen DD- Form. Eine Bindung von NOD1-spezifischen Liganden an NOD2 konnten nicht beobachtet werden und unterstrich die Spezifität des angewandten Testsystems. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit belegen eine Expression von NOD1 und NOD2 in murinen Präadipozyten und zeigen erstmals eine Interaktion von NOD2 mit MDP auf molekularer Ebene.

Hypertrophy of the mesenteric fat around inflamed areas of the intestine is a characteristic phenomenon observed in Crohn’s disease. Aim of the present study was the characterisation of the immunological repertoire of progenitor cells derived from mesenteric fat and focussed on the recently discovered cytosolic pattern recognition receptors named Nucleotide Oligomerization Domain (NOD)-protein 1 and 2, the latter is associated with susceptibility to Crohn’s disease. At transcript level, baseline expression of NOD1 in murine preadipocytes was similar to NOD1 expression in bone marrow-derived macrophages and more pronounced than the expression of NOD2. In Western blot analysis expression of both NOD1 and NOD2 in murine preadipocytes could be demonstrated. The expression of NOD2 specific mRNA in preadipocytes could be modulated by cytokines representing a proinflammatory milieu and by bacterial cell wall-derived compounds which can be found in mesenteric fat during chronic intestinal inflammation through bacterial translocation. Functional studies demonstrated a Nuclear Factor (NF)κB-dependent production of IL-6 after stimulation of murine preadipocytes with the NOD1-specific ligand lactyl-tetra-diaminopimelic acid (LT-DAP). Transfection of eukaryotic cells represented an essential method for functional studies resulting in the construction of a novel system for electroporation. This electroporation strategy, provided by the modular ELPorator 1000 device, applies continuous combined High Voltage (HV) and Low Voltage (LV) square pulses where the electric parameter of the effective field and the duration of each pulse can be defined individually. This method allows for highly efficient transfection of DNA or siRNA into isolated primary cell populations or within mixed cell suspensions as well as into other cell populations that are considered difficult to transfect. The initial HV pulse contributed to the number of transfected cells, while the longer LV pulse modulated the amount of transfected molecules. NOD1 specificity of LT-DAP was verified by NOD1 knockdown using specific Small Interfering (si)RNA. At the molecular level, the interaction of NOD2 with its postulated ligand MDP has not been proven in the literature to date. Thus, a test system to evaluate this interaction was established applying surface plasmon resonance spectroscopy. Therefore recombinant NOD2 fused to a Green Fluorescent Protein (EGFP)-Tag was expressed in eukaryotic cells and immobilized on the sensor chip via EGFP-specific antibodies. Results of these studies verified an interaction of MDP with NOD2 at the molecular level in both LD and its stimulatory inactive DD configuration. No interaction of NOD1-specific ligands with NOD2 could be observed underlining the specificity of the test system established. Data of this work provide evidence that NOD1 and NOD2 are expressed in preadipocytes and these receptors could be activated by bacterial translocation during intestinal inflammation and the interaction of NOD2 with MDP is shown for the first time at molecular level.