In-situ-Analyse der Infiltration kolorektaler Karzinome durch FOXP3+ regulatorische T-Zellen, CD3+ und CD8+ T-Zellen: Zusammenhänge mit der TAA-spezifischen T-Zell-Antwort, dem Stadium und dem Überleben

Abstract

Das Immunsystem ist grundsätzlich in der Lage, TAA-spezifische T-Zell- Antworten bei Patienten mit bösartigen Tumorerkrankungen zu generieren. Entsprechende tumorreaktive T-Zellen konnten bereits im unstimulierten, peripheren Blut von Patienten mit verschiedenen malignen Erkrankungen nachgewiesen werden. Allerdings konnte weder für spontane noch für durch Vakzine induzierte TAA-spezifische T-Zell-Antworten bei Patienten mit kolorektalem Karzinom (KRK) eine klinische Wirksamkeit gezeigt werden. Für dieses klinische Versagen der eigentlich gegen den Tumor gerichteten Immunantworten werden viele Ursachen diskutiert. Eine dieser Ursachen könnte in der immunsuppressiven Wirkung tumorinfiltrierender regulatorischer T-Zellen (Treg) begründet sein. In der vorliegenden Arbeit wird die Infiltration des KRK durch FOXP3+ Treg sowie durch CD3+ und CD8+ T-Zellen untersucht. Es wurde dabei der Zusammenhang zwischen diesen infiltrierenden Zellen, einer systemischen TAA-spezifischen T-Zell-Antwort, dem Krankheitsstadium und dem Überleben geprüft. Um die Treg mikroskopisch spezifisch identifizieren zu können, wurde die immunhistochemische Färbung des Transkriptionsfaktors „forkhead box P3“ (FOXP3) angewandt. Für die immunhistochemische Doppelfärbung von CD3 und FOXP3 wurde zunächst die Färbung des FOXP3-Proteins nach der polymerbasierten Peroxidase-Methode und anschließend die Membranfärbung von CD3 nach der APAAP-Methode durchgeführt. Ebenso wurde für die Färbung von CD8 die APAAP-Methode benutzt. Die Zellen wurden in jeweils 10 zufällig ausgewählten High Power Fields (1 HPF = 0,237mm2) manuell ausgezählt und gemittelt. Hierbei wurden die stromalen und epithelialen Anteile separat ausgewertet. Da das Stadium des KRK einen wesentlichen prognostischen Faktor darstellt, wurde für die Überlebensanalysen zusätzlich eine Stadienkorrektur durchgeführt. In allen 40 KRK-Proben wurde eine signifikant höhere Infiltration durch Treg gefunden als in den 12 Proben gesunder Kolonmukosa. Der hierbei ermittelte Unterschied war gleichermaßen im Epithel als auch im Tumorstroma/Lamina propria nachweisbar und betrug eine etwa um den Faktor 20 erhöhte Treg-Zellzahl im KRK. Die Infiltration im Stroma des KRK übertraf signifikant die Infiltration in den epithelialen Anteilen, wobei sich das gleiche Verteilungsmuster auch beim gesunden Kolongewebe zeigte. Des Weiteren war die Treg-Infiltration des KRK signifikant stärker bei den limitierten Stadien UICC I und UICC II als bei den metastasierten Stadien UICC III und IV (15,6/HPF gegenüber 9,9/HPF, p = 0,04). Bei Patienten ohne eine systemische TAA-spezifische T-Zell-Antwort war die durchschnittliche Infiltration durch Treg etwas stärker ausgeprägt als bei Patienten mit einer entsprechenden T -Zell-Antwort (14,1/HPF gegenüber 9,6/HPF, p = 0,16). Auch wenn dieser Unterschied nicht signifikant war, könnte dies ein erster Hinweis auf eine T -Zell-Antwort-hemmende Rolle von tumorinfiltrierenden Treg beim KRK sein. Bezüglich des Überlebens gab es keinen Unterschied zwischen einer starken und einer schwachen Treg-Infiltration. Auch die Untersuchung des KRK auf CD3+ und CD8+ T-Zellen ergab eine signifikant stärkere Infiltration im Vergleich zu gesundem Kolongewebe. Dieser Unterschied basierte fast ausschließlich auf einer stärkeren stromalen Infiltration des Tumors. Ein Trend zu einem besseren Überleben war bei Patienten mit einer hohen CD3+ und auch CD8+ Infiltration im Stroma des KRK feststellbar. Nach der Durchführung einer stadienkorrigierten Analyse trat dieser Unterschied allerdings nicht mehr auf, so dass es sich möglicherweise nur um ein Epiphänomen – bedingt durch die bevorzugten pathomorphologischen Merkmale des jeweiligen Krankheitsstadiums – handeln könnte. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass eine direkte Verbindung zwischen der Tumorinfiltration durch Treg und der Ausbildung einer TAA- spezifischen T-Zell-Antwort nicht belegt werden kann. Allerdings war eine signifikant erhöhte Treg-Infiltration bei den limitierten Stadien der Erkrankung zu verzeichnen, in denen wiederum eine systemische TAA-spezifische T-Zell-Antwort seltener zu beobachten ist. Weitere Untersuchungen hinsichtlich eines möglichen Einflusses tumorinfiltrierender Treg auf die Ausbildung spontaner T-Zell-Antworten sind nötig, um die vorliegenden Ergebnisse und deren Relevanz im Hinblick auf die Entwicklung zukünftiger Vakzinierungsstrategien richtig einzuordnen.

The immune system is potentially able to develop tumor associated antigen(TAA)-specific T cell responses in patients with malignant tumors. Corresponding tumor-reactive T cells already have been detected in the unstimulated, peripheral blood of patients with various malignant diseases. However neither for spontaneous nor for vaccine-induced TAA-directed immunological responses could a notable clinical effectivity be demonstrated in colorectal cancer (CRC) patients. Various explanations for this clinical failure of the immune response directed against the tumor have been discussed, among them the immunosuppressive effect of tumor-infiltrating regulatory T cells (Treg). This doctoral thesis examines the infiltration of CRC by FOXP3+ Treg, as well as by CD3+ and CD8+ T cells, analyzing the interrelationship between the infiltrating cells, a systemic TAA-specific T cell response and the survival. To specifically identify the regulatory T cells immunostaining of the transcription factor “forkhead box P3” (FOXP3) was utilised. For double immunoenzymatic labeling of CD3 and FOXP3, the polymer-based peroxidase method was applied for staining of FOXP3, followed by the labeling of CD3 using the alkaline phosphatase anti-alkaline phophatase complex (APAAP) method. The APAAP method was also used for immunostaining of CD8. Ten randomly selected high power fields (1 HPF = 0,236mm2) were analysed for cell infiltration and the number of cells avaraged in each case. In the course of this, stromal and epithelial portions were evaluated separately. Due to the fact that disease stage presents a substantial prognostic factor we additionally applied a stage correction for all survival analyses. In 40 CRC biopsy samples, a significantly higher infiltration by regulatory T cells was found than in the 12 samples healthy colon tissue. The difference determined here was verifiable both for the epithelium and the stroma/lamina propria, representing an approximately 20-fold increase of infiltrating Treg in CRC. A significantly higher Treg infiltration was found in the CRC stroma than in the tumor epithelium. This distribution pattern also appeared in the samples of healthy colon mucosa. Furthermore the Treg infiltration was significantly higher in the limited stages UICC I and II than in the metastatic stages UICC III and IV (15.6/HPF vs. 9.9/HPF, p = 0.04). In patients without TAA-specific T cell response the mean total Treg infiltration was modestly higher than in patients with such a T cell response (14.1/HPF vs. 9.6/HPF, p = 0.16). Although these differences were not significant, this may be a first indication of a T cell response-suppressing role of tumor-infiltrating Treg in CRC. No association was found between total Treg infiltration and survival neither with nor without stage correction. Regarding intratumoral CD3+ and CD8+ T cells, a significantly higher infiltration was found in CRC than in healthy colon tissue. This difference was mainly due to a stronger stromal infiltration of the tumor. In patients with high CD3+ and also CD8+ infiltration of the CRC stroma, a statistical trend towards better survival was observed. Interestingly, after performing a stage correction this trend was no longer apparent. Thus it is possible that the trend observed could represent an epiphenomenon. In conclusion it can be said that a direct link between the Treg infiltration of CRC and the development of a systemic TAA-specific T cell response cannot be proven. However, the local Treg infiltration was significantly higher in limited disease, in which a systemic T cell response is less frequently observed. Further investigations, which should address a possible influence of tumor infiltrating Treg on the development of spontaneous T cell responses, are needed to assess these results and their relevance in regard to new vaccination strategies.