Mechanisms of action of bisphosphonates in melanoma cell lines in vitro

Abstract

Bisphosphonates are synthetic pyrophosphate-analogues well established in the treatement of osteoclast -mediated resorbtive bone diseases including osteoporosis, Paget's disease and tumor-induced osteolysis. Recent studies suggest that , beside inhibiting bone resorbtion, bisphosphonates may also exert a direct antitumor effect, and this class of drugs has been shown to inhibit proliferation and to induce apoptosis in vitro in different human tumor cell lines. For the nitrogen- containing sub- class of bisphosphonates, this anti-neoplastic activity could be related to the inhibition of the mevalonate pathway and, consequently, of the prenylation of signalling proteins such as the small GTPases. The present study compared for the first time the in vitro effects of different bisphosphonates on melanoma cell lines. Three compounds with different mechanism of action and different antiresorptive potency were analysed: a non-amino-bisphosphonate (clodronate) and two amino- bisphosphonates, pamidronate and zoledronate, which is the most potent antiresorptive agent known to date. Their effects on cell proliferation, induction of apoptosis and cell cycle progression in the melanoma cell lines A375 and M186 and in the Bcl-2 overexpressing cell line A375/ Bcl-2 have been investigated in detail. In this experimental model, it could be shown that the nitrogen-containing bisphosphonates inhibit cell proliferation, induce apoptosis and alter cell cycle progression causing accumulation of cells in the S phase of the cycle. The antiproliferative and proapoptotic activity of the two compounds in vitro did not correlate well with their known antiresorptive potency in vivo. Apoptosis induced by the amino-bisphosphonates was dose and time dependent and acute exposure to pamidronate over 6h was sufficient to induce apoptosis. The pro-apoptotic effect of pamidronate and zoledronate was not inhibited by overexpression of Bcl-2 protein and did not appear to involve of cytochrome c release from the mitochondria, suggesting that these compounds may stimulate a mitochondria- independent pathway for inducing apoptotosis. In contrast, the non-amino- bishophonate clodronate had no effect on cell proliferation, apoptosis induction or cell cycle progression in melanoma cell lines, even at high concentrations. In conclusion, amino-bisphosphonates manifest a direct antitumoral effect on melanoma cells in vitro, and may thus represent a promising novel class of agents for the treatment/prevention of melanoma metastasis. Further studies are required, in order to describe the exact mechanism of action of these compounds, their most effective structures and ultimately their potential place in new strategies for adjuvant therapy schedules in malignant melanoma.

Bisphosphonate stellen eine Klasse der synthetischen Analoga des endogenen Pyrophosphats dar, die heutzutage einen breiten klinischen Einsatz in der Therapie der Osteoklast-vermittelten Knochenstoffwechselerkrankungen wie Morbus Paget, Osteoporose und Tumorosteolyse haben. Neuere Studien weisen darauf hin, dass Bisphosphonate ausserhalb ihres osteoprotektiven Effekts, auch eine direkte antitumorale Wirkung zeigen und antiproliferativ und pro- apoptotisch in verschiedenen Typen von humanen Tumoren in vitro wirken. Im Fall der stickstoffhaltigen Bisphosphonate könnte die antineoplasische Wirkung durch die Hemmung der Enzyme des Mevalonat-Stoffwechselweges erklärt werden, die zur Inhibition der Prenylierung und dadurch zur Inaktivierung unterschiedlicher Signalmoleküle führt. In der vorliegenden Arbeit wurden die Effekte von verschiedenen Bisphosphonaten mit unterschiedlichen antiresorptiven Wirkungen und Wirkungsmechanismen in Melanom-Zelllinien in vitro untersucht. Der Einfluss der Aminobisphosphonate Pamidronat und Zoledronate sowie des Nichtaminobisphosphonates Clodronat auf die Zellproliferation, Apoptoseinduktion und Zellzyklusprogression in der Melanomzelllinien A 375, M186 und in der Bcl-2 überexprimierenden Zelllinie A 375/Bcl-2 wurde bestimmt. Es konnte gezeigt werden, dass die stickstoffhaltigen Bisphosphonate die Zellproliferation hemmen, Apoptosis auslösen und die Zellzyklusprogression durch eine Akkumulation der Zellen in der S Phase beeinträchtigen. Diese Wirkungen waren konzentrationsabhängig und korrelierten nicht mit der klinisch beschriebenen antiresorptiven Potenz der Medikamente. Die durch stickstoffhaltige Bisphosphonate ausgelöste Apoptose war zeitabhängig und konnte nach 6 Std Inkubation mit Pamidronat nachgewiesen werden. Die proapoptotische Wirkung der Aminobisphosphonate lies sich durch die Überexpression des Proteins Bcl-2 nicht hemmen und schien unabhängig von der Cytochrome C-Freisetzung zu sein, so dass die Auslösung der Apoptose mittels Amninobisphosphonate durch einen Mitochondrien-unabhängigen Weg angenommen werden kann. Im Gegensatz dazu konnte der Einfluss des Nichtaminobisphosphonates Clodronat auf die Zellproliferation, Apoptoseinduktion oder Zellzyklusprogression in den untersuchten Zelllinien nicht nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse unterstützen weiterhin die Hypothese, dass Amino-bzw Nichtaminobisphosphonate über unterschiedliche Mechanismen ihre Wirkung entfalten können. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass Aminobisphosphonate eine direkte antitumorale Wirkung in Melanomzellen in vitro zeigen und dadurch eine interessante Möglichkeit für die Entwicklung neuer Strategien für die Behandlung bzw. Prävention der Melanom-Metastasen darstellen.