Structural Investigations of MHC Class II Conformers

Abstract

Molecules of the major histocompatibility complex (MHC) present antigenic peptides for surveillance by T cells and, thereby, are central for the initiation of an adaptive immune response. The structure of MHC class II (MHC II) has been known for almost 20 years and all structures solved so far show a single overall conformation. However, there is ample evidence for variations of this uniform picture. In this thesis I wanted to lay the structural basis for these conformers. Empty MHC II molecules quickly lose their ability to rebind peptides, what is thought to be accompanied by a conformational change, but direct structural proof is missing. Here, a molecular dynamics simulations-derived model for the transition of empty MHC II from a peptide- receptive to a non-receptive state is presented. It predicts a closure of the binding site by straightening and inwards movement of a flanking helix, stabilized by the formation of a hydrogen bond between highly conserved residues, functioning as lock. This model was verified by in vitro mutagenesis studies. First, an intramolecular disulfide bridge was designed that proved the conformational flexibility predicted by the model. More importantly, disabling the locking mechanism by mutagenesis led to highly peptide receptive MHC II species. Thus, the data presented here strongly supports the postulated model for the non-receptive state of MHC II. In addition, also ligand- dependent conformers of MHC II have been described. For the human leukocyte antigen (HLA)-DR1 it has been reported that terminal extension of peptide ligands beyond the core binding motif influences the MHC II conformation. Here, the structural basis for this effect was probed by X-ray crystallography. Structures of four HLA-DR1 molecules in complex with length variants of a viral antigen were solved, but no conformational difference was identified. In contrast, X-ray crystallography of HLA-DR1 in complex with two length variants of the class II-associated invariant chain derived peptide (CLIP), a natural intermediate in antigen-processing, surprisingly revealed a new conformation. The short version of CLIP was found in an inversed orientation as compared to the canonical binding mode. Remarkably, no rearrangements in the binding groove were necessary to establish the same conserved hydrogen bonding network for both directions. Accompanying NMR experiments proved that thermodynamic stability of the complex drives CLIP to reorient within the binding groove from the canonical to the reversed state. It was possible to trap the antigen in only one orientation by introduction of favorable anchors. Finally, after screening databases for other potentially reversed antigens, five new HLA-DR1 structures with different peptides were solved. However, none of these showed the non-canonical binding mode. Instead, the structures illustrated the high adaptability of the MHC to different peptide sequences, e.g. by a before unseen opening of the binding pocket 7. In conclusion, the structures of several pMHC II suggest a novel peptide binding mode and underscore the various strategies of MHC II to form highly stable peptide complexes.

Moleküle des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) präsentieren Antigenpeptide für die Überwachung durch T-Zellen und sind somit ein zentraler Bestandteil der adaptiven Immunantwort. Die Struktur von MHC Klasse II (MHC II) Komplexen ist seit fast 20 Jahren bekannt und alle Strukturen zeigen eine einheitliche Konformation. Es gibt jedoch reichhaltige Beweise für weitere Konformationen. Mit der vorliegenden Arbeit möchte ich die strukturelle Grundlage hierfür legen. Leere MHC II Moleküle verlieren schnell die Fähigkeit, erneut Peptide zu binden. Es wird angenommen, dass dies mit einer Änderung ihrer Konformation einhergeht, aber bislang fehlt ein direkter struktureller Beweis. In dieser Arbeit wird ein Modell für den Übergang von einem peptidrezeptiven zu einem nicht rezeptiven Zustand vorgestellt, das auf Simulation der Molekulardynamik des leeren MHC basiert. Dabei bewirkt die Streckung und Einwärtsbewegung einer flankierenden Helix das Verschließen der Antigenbindungsstelle, was durch die Ausbildung einer als Verschluss fungierenden Wasserstoffbrückenbindung zwischen hoch konservierten Aminosäuren stabilisiert wird. Dieses Modell konnte durch in vitro Mutagenesestudien verifiziert werden. Dafür wurde zunächst eine intramolekulare Schwefelbrücke eingebaut, die die konformationelle Flexibilität des Modells bewies. Von größerer Bedeutung war jedoch die Erkenntis, dass das Ausschalten des Verschlussmechanismus zu einer hoch peptidrezeptiven MHC II Art führte. Die vorgelegten Daten unterstützen somit das postulierte Modell des nicht- rezeptiven MHC II. Weiterhin sind auch ligandabhängige MHC II Konformationen beschrieben worden. Die Konformation des humanen Leukozytenantigen (HLA)-DR1 wird beispielsweise durch Verlängerungen der Peptidligandentermini über das Kernbindungsmotiv hinaus beeinflusst. Die strukturelle Basis hierfür wurde mittels Röntgenstrukturanalyse untersucht. Dabei wurden vier Strukturen von HLA-DR1 im Komplex mit Längenvarianten eines viralen Antigens gelöst, wobei jedoch keine Änderung in der Konformation zu beobachten war. Im Gegensatz dazu zeigte die Röntgenstrukturanalyse von HLA-DR1 im Komplex mit zwei Längenvarianten des „class II-associated invariant chain derived peptide“ (CLIP), ein natürliches Intermediat bei der Antigenprozessierung, überraschenderweise eine neuartige Konformation. Die kürzere CLIP Version lag, im Vergleich zur kanonischen Bindungsweise, umgedreht in der Antigenbindungstasche. Dabei waren bemerkenswerterweise keine Änderungen innerhalb der Bindungsfurche nötig, um dasselbe konservierte Wasserstoffbrückennetzwerk für beide Richtungen auszubilden. Begleitende NMR- Experimente bewiesen, dass die Neuorientierung des Peptides durch die thermodynamische Stabilität des Komplexes angetrieben wurde. Es war möglich, diese Neuorientierung durch den Einbau von Peptidankern zu beeinflussen. Zusätzlich wurden Datenbanken nach weiteren potentiell umgedrehten Peptiden durchsucht und fünf neue Strukturen von HLA-DR1 im Komplex mit unterschiedlichen Peptiden gelöst. Dabei zeigte jedoch keine die gewünschte Orientierung. Stattdessen betonten sie die hohe Anpassungsfähigkeit des MHC an verschiedene Peptidsequenzen, z.B. durch eine zuvor unbeobachtete Öffnung der Bindungstasche 7. Zusammenfassend deuten die verschiedenen Strukturen von Peptid-MHC II Komplexen einen neuartigen Peptidbindungsmodus an und unterstreichen die verschiedenen Möglichkeiten des MHC II, hochstabile Peptidkomplexe auszubilden.