Die Rolle des Transkriptionsfaktors NF-κB bei der Skelettmuskelzelldifferenzierung: physiologische und pathologische Aspekte

Abstract

Die Funktion des Transkriptionsfaktors NF-κB (Nuclear factor-ĸB) während der normalen Muskelzelldifferenzierung wird in der Literatur kontrovers diskutiert. Einige Autoren konnten einen differenzierungsfördernden, andere Autoren einen differenzierungshemmenden und wieder andere Autoren einen sowohl fördernden als auch hemmenden Effekt von NF-κB auf den Differenzierungsprozess nachweisen. Über eine mögliche Rolle des NF-κB bei der Pathogenese des Rhabdomyosarkoms war vor Beginn dieser Arbeit nichts bekannt. Von diesem Tumortyp ist jedoch bekannt, dass ein höherer Differenzierungsstatus zu einem Verlust der Metastasierungsfähigkeit der entsprechenden Zellen führt. Es könnte daher ein Zusammenhang zwischen der unvollständigen Differenzierung von Rhabdomyosarkomen und einer Fehlregulation der NF-κB-Aktivität bestehen. Für diese Hypothese spricht auch, dass bereits in einer Vielzahl von anderen Tumortypen eine vom entsprechenden Normalgewebe abweichende NF-κB-Aktivität nachgewiesen werden konnte. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst die NF- κB-Aktivität in der nichttransformierten Myoblastenzelllinie C2C12 und den Rhabdomyosarkomzelllinien RD/18, RD/12 und CCA nach Induktion der myogenen Differenzierung in vitro analysiert. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigten in C2C12-Zellen eine absinkende NF-κB-Aktivität nach Induktion der Differenzierung. Im Gegensatz dazu konnte in den Rhabdomyosarkomzellen eine gleichbleibend hohe NF-κB-Aktivität während des gesamten Differenzierungsprozesses beobachtet werden. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass eine Repression der NF ĸB-Aktivität für eine normale myogene Differenzierung notwendig sein könnte. Die von nichttransformierten Myoblasten abweichende Regulation der NF-κB-Aktivität in Rhabdomyosarkomzellen könnte also die Ursache für das geringe Differenzierungspotential oder aber die Folge des geringeren Differenzierungspotentials dieser Zellen sein. Als nächster Schritt wurden die Auswirkungen einer Hemmung der NF-κB-Aktivität auf den Differenzierungsprozess der verschiedenen Zelllinien analysiert. Erstaunlicherweise wirkte sich diese Hemmung sowohl bei den C2C12-Zellen als auch bei den RD/18-, RD/12- und CCA-Zellen hemmend auf den Differenzierungsprozess aus. Diese Ergebnisse sprechen somit eher für eine differenzierungsfördernde Funktion des NF-κB. Eine mögliche Erklärung für diese gegensätzlichen Ergebnisse bietet die Hypothese, dass NF-κB initial eine differenzierungsfördernde und im weiteren Differenzierungsverlauf eine differenzierungshemmende Funktion besitzt. Tumor necrosis factor receptor associated factor 6 (TRAF6) ist ein zytoplasmatisches Adaptorprotein, das an der Aktivierung des NF-κB in vielen Zelltypen beteiligt ist. Im Vorfeld dieser Arbeit konnte unsere Arbeitsgruppe auf mRNA-Ebene eine Repression der traf6-Expression während der Muskelzelldifferenzierung in nichttransformierten Myoblasten zeigen. Im Gegensatz dazu konnte in Rhabdomyosarkomzellen keine Repression der traf6-Expression nach Induktion der Differenzierung festgestellt werden. In dieser Arbeit wurde die Expression des für TRAF6 kodierenden Gens auf Proteinebene in der nichttransformierten Myoblastenzelllinie C2C12 und den Rhabdomyosarkomzelllinien RD/18, RD/12 und CCA untersucht. Dabei zeigte sich, dass in proliferierenden Zellen die traf6-Expression in den Rhabdomyosarkomzellen deutlich höher war als in den C2C12-Zellen. Aus der Untersuchung der traf6-Expression im Differenzierungsverlauf der C2C12-Zellen ergaben sich widersprüchliche Ergebnisse, so dass die auf mRNA-Ebene erhaltenen Ergebnisse weder bestätigt noch widerlegt werden konnten. In allen drei Rhabdomyosarkom-zelllinien zeigte sich hingegen eine eindeutige Induktion der traf6-Expression während der Differenzierung. Somit konnten die Ergebnisse dieser Arbeit die zuvor erhaltenen Ergebnisse zum Teil bestätigen. Demnach könnte ein bedeutender Unterschied in der traf6-Expression zwischen nichttransformierten Myoblasten und Rhabdomyosarkomzellen bestehen, der zumindest zum Teil für die unterschiedliche Regulation der NF-κB-Aktivität in diesen Zelltypen verantwortlich sein könnte. Weiterhin gab es aufgrund früherer Daten unserer Arbeitsgruppe Anzeichen dafür, dass ein Zusammenhang zwischen der NF-κB- Aktivität und der traf6-Expression bestehen könnte, also dass die Expression des traf6-Gens selbst der Regulation durch NF-κB unterliegen könnte. Zur Überprüfung dieser Hypothese wurde in dieser Arbeit die NF-κB-Aktivität gehemmt und anschließend die traf6-Expression auf Proteinebene untersucht. Dabei war jedoch kein Effekt auf die traf6-Expression zu beobachten. Die Regulation des traf6-Gens durch NF-κB konnte somit in dieser Arbeit nicht bestätigt werden. Insgesamt zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit, dass die Aktivität des Transkriptionsfaktors NF-κB in nichttransformierten Myoblasten und in Rhabdomyosarkom-zellen unterschiedlich reguliert wird, was zumindest zum Teil in einer differentiellen Expression des für den NF-κB- Aktivator TRAF6 kodierenden Gens begründet sein könnte.

The function of the transcription factor NF-ĸB (Nuclear factor-ĸB) in normal muscle cell differentiation has been discussed controversially in the literature. Various authors could demonstrate a differentiation-promoting, others found a differentiation-inhibiting effect and yet others show evidence for both differentiation-promoting and -inhibiting effects of NF ĸB in myogenic differentiation. Prior to this work, nothing was known on a potential role of NF-ĸB in rhabdomyosarcoma pathogenesis. However, it has been known for quite a while that in rhabdomyosarcoma cells, a higher state of differentiation leads to a loss of the metastatic potential of the respective cells. Therefore, a relation between the incomplete differentiation of rhabdomyosarcomas and a dysregulation of NF-ĸB-activity could exist. This hypothesis is supported by experimental data from a variety of other types of tumors, in which an abnormal NF ĸB-activity could be found. In the present work, the NF-ĸB-activity in the normal myoblast cell line C2C12 and the rhabdomyosarcoma cell lines RD/18, RD/12, and CCA after the induction of differentiation in vitro was analyzed first. The results of this examination showed a decreasing NF-ĸB-activity in C2C12 cells after the induction of differentiation. On the contrary, the analyzed rhabdomyosarcoma cells showed steady NF-ĸB-activity during the whole process of differentiation. These results support the hypothesis that a certain repression of NF-ĸB-activity is necessary for normal myogenic differentiation. Furthermore, the different regulation of NF-ĸB activity in rhabdomyosarcoma cells when compared to normal myoblasts might be the cause or a result of the diminished differentiation potential of the former. In a next step, the effects of an inhibition of NF- ĸB-activity on the process of differentiation in the different cell lines were analyzed. Surprisingly, blocking NF-ĸB-activity had an inhibiting effect on the differentiation process of C2C12, RD/18, RD/12, and CCA cells. These results rather argue for a differentiation-promoting effect of NF-ĸB. A possible explanation for these controversial results is provided by the hypothesis that NF ĸB might be differentiation-promoting at early, and differentiation-inhibiting at later stages of the differentiation process. Tumor necrosis factor receptor associated factor 6 (TRAF6) is a cytoplasmic adaptor protein that is involved in the activation of NF-ĸB in many cell types. Prior to this work, our laboratory could demonstrate a repression of traf6 expression at the mRNA level in normal muscle cell differentiation. On the contrary, in rhabdomyosarcoma cells, no repression of traf6 expression after the induction of differentiation was observed. In this work, we analyzed the expression of the traf6 gene at the protein level both in the normal myoblast cell line C2C12 and in the rhabdomyosarcoma cell lines RD/18, RD/12, and CCA. The results showed a higher traf6 expression in proliferating rhabdomyosarcoma cells than in proliferating normal myoblasts. The examination of traf6 expression in C2C12 differentiation showed controversial results, thus the abovementioned mRNA results could neither be proved nor disproved at the protein level. By contrast, in all rhabdomyosarcoma cell lines, a clear induction of traf6 expression in differentiation was observed. Consequently, these results could partially confirm the prior results. Specifically, the data indicate that there could be an important difference between the traf6 expression of normal myoblasts and rhabdomyosarcoma cells. This difference could be a reason for the differential regulation of the NF-ĸB-activity in the various cell types. Finally, prior results of our laboratory had indicated that there could be a link between NF ĸB activity and the expression of the traf6 gene. To test this hypothesis, we first inhibited NF-ĸB-activity and subsequently, we analyzed traf6 expression at the protein level. However, no effect of this treatment on traf6 expression could be observed. Consequently, regulation of the traf6 gene by NF-ĸB couldn`t be confirmed. Taken together, the results of this work show differences in the regulation of NF-ĸB activity in normal myoblasts and rhabdomyosarcoma cells. This could at least in part be the result of differential expression of the gene encoding the NF-ĸB activator TRAF6.