Untersuchungen zur Toxizität von Hyperoxie auf proliferierende neuronale Zellen

Abstract

Die Fortschritte in der neonatalen Intensivmedizin haben zwar die Überlebensrate von Frühgeborenen deutlich verbessert, jedoch ist damit auch das Risiko von Folgeerkrankungen gestiegen. Ein großer Teil ehemaliger Frühgeborener weist entwicklungsneurologische Defizite auf, die nur zum Teil mit periventrikulärer Leukomalazie in Zusammenhang stehen. Es gibt Hinweise darauf, dass auch neuronale Apoptose eine Rolle spielt. Für die unreifen, zum Teil noch proliferierenden, zum Teil differenzierenden neuronalen Zellen Frühgeborener stellt der postnatal herrschende Sauerstoffpartialdruck auch ohne zusätzliche Sauerstoffapplikation einen Zustand der relativen Hyperoxie dar. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit am Modell der mit NGF differenzierbaren PC12-Zelllinie untersucht, welche Auswirkungen Hyperoxie (80% O2) auf proliferierende neuronale Zellen im Vergleich mit terminal differenzierten neuronalen Zellen hat. Hyperoxie-Exposition proliferierender neuronaler Zellen über 24 und 48 Stunden führte zu einem Zellzyklusarrest in der S-Phase sowie zu einem Anstieg des Anteils apoptotischer Zellen. Hyperoxie-Exposition führte zu oxidativem Stress, verbunden mit einer Akkumulation von ROS (CM-H2DCF-DA-Assay), die noch stärker nachweisbar war nach Limitierung des wichtigsten intrazellulären Anitoxidants GSH durch 24stündige Präinkubation mit dem GSH-Synthese-Inhibitor BSO und anschließende Hyperoxie-Exposition. Mit Hilfe des Zellaktivitätstests (MTT) und verschiedener Apoptose-Marker (Annexin V-Propidiumjodid-Färbung, Caspase-3-Aktivierung) konnte nachgewiesen werden, dass kombinierte BSO- Hyperoxie-Exposition bei proliferierenden neuronalen Zellen zu einem Abfall der Zellaktivität durch Apoptose führt, bestätigt durch Inhibition des Zelltodes mit dem Pan-Caspase-Inhibitor z-vad.fmk. Zum Teil scheint die Toxizität durch Aktivierung der p42/44-MAPK induziert zu sein, wie die Inhibition des BSO-Hyperoxie-induzierten Zelltodes durch den p42/44-MAPK- Inhibitor U0126 zeigt. NGF-differenzierte neuronale Zellen zeigten weder einen S-Phase-Arrest nach Hyperoxie-Exposition noch Apoptose oder einen Abfall der Zellaktivität nach kombinierter BSO-Hyperoxie-Exposition. Der durch NGF induzierte Schutz war bereits 24 Stunden nach NGF-Zugabe nachweisbar, die Inhibition des Schutzes durch CHX weist auf eine Beteiligung der Proteinneusynthese hin. In dieser Arbeit konnte auf der Zellebene der Neuronen gezeigt werden, dass Hyperoxie-Exposition proliferierender neuronaler Zellen in Kombination mit limitiertem antioxidativem Schutz durch Akkumultaion von ROS zu apoptotischem Zelltod führt, während differenzierte neuronale Zellen unempfindlich sind. Es zeigt sich also auf Zellebene proliferierender Neuronen eine Hyperoxie-Sensitivität, die bei Frühgeborenen einen noch vorsichtigen Umgang in der therapeutischen Anwendung von Sauerstoff sinnvoll erscheinen lassen.

Improvements in neonatal intensive care have resulted in an increased survival of preterm human infants, associated with an increased number of former preterm infants with neurodevelopmental impairment. Cognitive deficits in later life, frequent in preterm infants, are only partly explained by periventricular leukomalacia. Several studies suggest that neuronal apoptosis in the developing brain may be a reason for the long-term brain dysfunction in preterm infants. Preterm infants are exposed to partial oxygen pressures that are substantial higher than the intrauterine conditions appropriate for the state of development of their immature brain cells. In this study, the PC12 cell line, which differentiates into terminal neurons after stimulation with NGF, was used to examine the effects of hyperoxia (80% O2) on immature proliferating neuronal cells compared with mature differentiated neuronal cells. Exposure to hyperoxia for 24 and 48 hours lead to an S-phase arrest in cell cycle and an increasing fraction of apoptotic cells. Hyperoxia lead to oxidative stress and accumulation of reactive oxygen species (ROS), as shown in CM-H2DCF-DA-assays, which was further increased by 24 hours preincubation with the GSH-synthesis inhibitor BSO before exposure to hyperoxia. The cell activity assay (MTT) and several flow cytometrical apoptosis markers (annexinV/ propidium iodide staining, activated caspase 3) showed that combined BSO-hyperoxia-treatment lead to apoptotic cell death of proliferating neuronal PC12 cells. Involvement of caspases was also shown by inhibition of cell death by the pan caspase inhibitor z-vad.fmk. The toxicity seems to be partly induced by activation of p42/44-MAPK, shown by the inhibition of cell death by the specific p42/44-MAPK inhibitor U0126. NGF-differentiated (7 days) neuronal cells showed neither an S-phase arrest in cell cycle after exposure to hyperoxia nor decreased cell activity or increased apoptosis after combined BSO-hyperoxia-treatment. NGF induced protection against oxidative stress was already detectable after 24 hours preincubation with NGF. Inhibition of NGF- induced protection by CHX suggest that protection requires de novo protein synthesis. This study showed that exposure of proliferating neuronal cells with limited antioxidative reserves to hyperoxia leads to accumulation of ROS and apoptotic cell death, while differentiated neuronal cells are less sensitive to this treatment. These findings suggest that further limiting oxygen exposure might be important in preventing neuronal damage in preterm human infants.