Thermostability of selected viruses in the presence of liquid egg yolk and distribution of virus during acetone extraction and microfiltration of egg yolk phospholipids

Abstract

The present study was designed to (1) compare the stability of avian influenza virus (AIV), Newcastle disease virus (NDV), feline calicivirus (FCV) and porcine parvovirus (PPV) at 40˚°C, 60˚°C and 80˚°C and to assess the influence of egg yolk ingredients on the thermal inactivation of AIV, NDV and FCV; (2) examine and compare the thermal inactivation between three subtypes of swine influenza virus (SIV; H1N1, H1N2 and H3N2) and one avian influenza virus (AIV; H7N1); (3) determine the influence of egg yolk powder and water concentration on virus inactivation during acetone extraction; and (4) evaluate the removal of virus from ethanolic extracts by microfiltration and compare the distribution of viral genome with virus infectivity in fractions after partitioning. The results revealed that (1) FCV was the virus most sensitive to heat inactivation at 40˚°C, followed by AIV and NDV. PPV was found to be the virus most resistant to heat inactivation. In two cases (AIV and NDV) the virus titres were reduced within 1 min of heat treatment at 60˚°C by a factor of ≥5 log10, nevertheless FCV was only reduced by a factor of 2.25 log10. After 6 h of heat treatment of PPV at 60˚°C no virus was detectable (≤0.5 log10 TCID50/ml). The mean starting virus titres of all viruses species (AIV, NDV, FCV) were rapidly reduced to ≤0.5 log10 TCID50/ml within 1 min and PPV after 6 h of heat treatment at 80°C, respectively. These experiments showed that the virus titres were reduced by heat treatment at 80˚°C by a factor of ≥5 log10. 2) Comparison of the viral persistence between different strains of influenza viruses (SIV and AIV) showed that the swine influenza strain H1N2 was the most heat resistant one at 40˚°C, followed by SIV strain H1N1, SIV strain H3N2 and AIV strain H7N1. These experiments indicate that the selection of virus strains used for inactivation experiments can be of importance for the validation of production processes with regard to the inactivation capacity of individual production steps. 3) During treatment at 60˚°C viruses in the presence of egg yolk showed a higher stability than the control virus without egg yolk. It is suggested that proteins and other components present in egg yolk provide partial protection of virus particles during heat exposure. During acetone extraction the egg yolk quantity in relation to the volume of the virus inoculum influenced the stability of the viruses (AIV and NDV). The mean starting virus titres of all concentrations of egg yolk powder were reduced by ≥ 4 log10 for the residue and the extract. Inactivation of NDV and AIV was stronger when the water concentration was high. 4) No infectious influenza virus could be detected after partitioning of virus-spiked ethanolic extracts in the filtrate or on the filter parts. However, after microfiltration AIV genomes or genome equivalents were detected in both fractions.

In dieser Arbeit sollten verschiedene Fragen zur Virussicherheit von Eiprodukten, die für pharmakologische Präparate eingesetzt werden können, beantwortet werden. Dazu wurden einzelne Reinigungsschritte für die Herstellung von Ei-Lecithin untersucht: 1) geklärt werden sollte die Hitzestabilität von aviären Influenza-Viren (AIV), Newcastle Disease Virus (NDV), Calizivirus der Katze (feline calicivirus [FCV]) und das Schweineparvovirus (porcine parvovirus [PPV]) bei verschiedenen Inkubationstemperaturen: 40˚°C, 60˚°C und 80˚°C. Zudem sollte der Einfluss von Eidotterproteinen auf die Inaktivierungskinetik von AIV, NDV und FCV während der Hitzebehandlung untersucht werden. 2) In vergleichenden Untersuchungen sollte der Frage nachgegangen werden, inwieweit Unterschiede in der Inaktivierungskinetik verschiedener Influenzavirus- Stämme bestehen. Hierfür wurden drei Subtypen von Schweineinfluenzaviren (SIVSubtypen H1N1, H1N2 und H3N2) sowie ein Geflügelinfluenzavirus (AIV SubtypH7N1) verglichen. 3) Ein wichtiger Schritt bei der Reinigung von Lecithin ist die Extraktion des Pulvers aus Eidotter. Untersucht werden sollte der Einfluss der Eidotterproteine sowie der Wasserkonzentration auf das Inaktivierungsverhalten der verschiedenen Viren. 4) Bei der Herstellung von pharmazeutischen Präparaten werden in der Regel Filtrationsschritte eingesetzt. Von Interesse war daher, inwieweit Viren sich durch die eingesetzten Filter nach Ethanolextraktion entfernen lassen und wie sich Infektiosität bzw. Viruspartikel auf die verschiedenen Fraktionen verteilen. Folgende Ergebnisse wurden in diesen Untersuchungen erzielt: 1) FCV wurde durch Hitzebehandlung bei 40˚°C schneller inaktiviert als AIV und NDV. PPV war recht stabil. Wurden die Viren bei einer Temperatur von 60˚°C behandelt, sank der Titer von AIV und NDV innerhalb von 1 min um einen Faktor von ≥5 log10, während FCV unter diesen Bedingungen nur um etwa einen Faktor von 2,25 log10 inaktiviert wurde. PPV erwies sich wieder als stabilstes Virus, dessen Titer erst nach einer sechsstündigen Inkubation unter die Nachweisgrenze gesunken war (≤0,5 log10 TCID50/ml). Inkubation der Virussuspensionen bei 80˚°C führte bei AIV, NDV und FCV innerhalb einer Minute zum vollständigen Verlust der Infektiosität (Nachweisgrenze ≤0,5 log10 TCID50/ml). Auch hier erwies sich PPV als ausgesprochen stabil, und der Titer war erst nach sechsstündiger Inkubation unter die Nachweisgrenze gefallen. Es konnte somit gezeigt werden, dass die Hitzebehandlung bei 8ä°C zu einem Titerabfall um einen Faktor von ≥5 log10 führt. 2) Die vergleichenden Untersuchungen zur Hitzestabilität verschiedener Influenzavirus-Stamme (SIV, AIV) zeigten, dass SIV Subtyp H1N2 während der Inkubation bei 4˚°C den geringsten Titerverlust aufwies, gefolgt von den Influenzaviren SIV H1N1, SIV H3N2 und AIV H7N1. Diese Ergebnisse belegen, dass die Auswahl von Virusisolaten zur Beurteilung von Inaktivierungsverfahren der Herstellung von pharmazeutischen Produkten von wesentlicher Bedeutung sein kann. 3) Bei der Herstellung pharmazeutischer Produkte wird häufig eine Hitzebehandlung bei 60˚°C durchgeführt. Die vorliegenden Untersuchungsergebnisse zeigen, dass Eidotterpulver die Stabilität der Viren bei dieser für die Pasteurisierung typischen Temperatur erhöht. Es wird diskutiert, dass Proteine oder andere Komponenten, die im Eidotter vorhanden sind, die Inaktivierung der Viren verzögern. 4) Der Versuchsaufbau ist für die Bewertung der Virussicherheit pharmazeutischer Produkte von großer Bedeutung. So hatte das Verhältnis von Eidotterpulver und Volumen an Virussuspension einen erheblichen Einfluss auf die Stabilität der Infektiosität von AIV und NDV. Obwohl unter allen Versuchsbedingungen eine Reduktion des Titers um einen Faktor von ≥ 4 log10 erreicht wurde, konnte nachgewiesen werden, dass bei höheren Wasseranteilen im Behandlungsansatz die Inaktivierung der Viren ausgeprägter war. 5) Ethanol inaktivierte Influenza bis unter die Nachweisgrenze, und infektiöses Virus konnte weder im Filtrat noch auf dem Filter nachgewiesen werden. Jedoch konnten mit der quantitativen PCR sowohl im Filtrat als auch auf dem Filter Virusgenomfragmente nachgewiesen werden. Die Validierung von drei typischen Schritten zur Reinigung von Lecithin aus Hühnereigelb zeigte, dass das Parvovirus (als Modell für nicht umhüllte Viren) unter den Versuchsbedingungen relativ stabil ist. Hingegen lassen sich die relevanten Viren AIV und NDV sowohl durch Hitzebehandlung, wie sie bei der Herstellung von Eigelbpulver angewendet wird (Pasteurisierung), als auch durch Reinigung von Lecithin aus Eigelb mit organischen Extraktionsmitteln effektiv inaktivieren.