Tight Junction-Proteine als regulierbare Kanal- und Barrierebildner

Abstract

Die Tight Junction determiniert den parazellulären Transport, wobei sie vorwiegend abdichtende Funktion hat. Dennoch gibt es zahlreiche Tight Junction-Proteine aus der Familie der Claudine, die eine Permeabilität vermitteln, indem sie parazellulär verlaufende Kanäle mit Selektivität für Kationen, Anionen oder Wasser bilden. Im ersten Unterthema dieser Habilitationsschrift geht es um ein – wie die Studien ergaben – kanalbildendes Tight Junction-Protein. Es zeigte sich, dass das bisher nicht charakterisierte Tight Junction-Protein Claudin-17 einen anionenselektiven parazellulären Kanal bildet und vorwiegend im proximalen Nephron lokalisiert ist. Seine Anionenselektivität wird von bestimmten geladenen Aminosäuren beider extrazellulärer Schleifen dieses Claudins verursacht. Die Übertragung dieser Aminosäurepositionen auf ein Claudin-17-Strukturmodell ergab, dass sich diese Aminosäurereste am Anfang, im Inneren und am Ende eines hypothetischen Porenverlaufs des Claudin-17-basierten Kanals befinden. Auf der Basis dieser Ergebnisse waren wir in der Lage, ein erstes hypothetisches Strukturmodell eines Claudinpolymer-basierten Anionenkanals zu präsentieren. Das zweite Unterthema fokussiert sich auf abdichtende Tight Junction-Proteine. Diese eignen sich als Angriffspunkte für parazellulär wirksame Absorptionsenhancer. Aufgabe von Absorptionsenhancern ist es, ansonsten schlecht resorbierbare mittel- bis makromolekulare hydrophile Solute – z.B. Medikamente – parazellulär durch Epi- oder Endothelien zu schleusen, indem sie eine kontrollierte transiente Öffnung der Tight Junction bewirken. Drei unterschiedliche Lösungsansätze werden präsentiert. In einer ersten Studie wurde der Signalweg aufgeklärt, über den Absorptionsenhancer an der peripheren Blut-Nerven-Barriere den Durchtritt von Lokalanästhetika erleichtern, indem sie Claudin-1 herabregulieren. In der zweiten Studie wurde eine geeignete Mutante des Clostridium perfringens-Enterotoxins benutzt, die mit mehreren abdichtenden Claudinen interagiert und diese funktionsuntüchtig macht. In der dritten Studie zu diesem Unterthema wurde der Effekt des Fettsäuresalzes Caprat untersucht, mit dem Ergebnis, dass es das abdichtende Protein Claudin-5 aus der bi-zellulären Tight Junction als auch Tricellulin aus der trizellulären Tight Junction dislozierte. Wir konnten fluoreszenzoptisch zeigen, dass ein 607 Da großes Molekül (Biotin) nach Capratgabe durch die trizelluläre Tight Junction gelangt. Aus unseren Daten leiten wir eine neuartige Hypothese für den Transportweg für Ionen und Makromoleküle ab: Während Ionen und kleine Solute in quantitativ bedeutsamer Menge durch Claudin-basierte parazelluläre Kanäle der bizellulären Tight Junction passieren, können Makromoleküle das Epithel durch die etwa 10 nm große Zentralpore der trizellulären Tight Junction passieren.

The tight junction determines paracellular transport having mainly sealing function. However, numerous tight junction proteins belonging to the family of claudins mediate permeability by forming paracellular channels with specific selectivity for cations, anions or water. The first subchapter of this essay deals with a channel-forming tight junction protein. It was shown that the so far uncharacterized claudin-17 forms anion-selective paracellular channels and was predominantly localized within the nephron. The observed anion selectivity was determinated by charged amino acids of its both extracellular loops. Transfer of these positions onto a structural model of claudin-17 showed that the respective residues were located at the beginning, inside and at the end of a hypothetical furrow of the claudin-17 based channel. Based on these results a first hypothetical structural model of a claudin-polymer-formed anion channel was presented. The second subchapter focused on barrier-forming tight junction proteins. These qualify as targets of absorption enhancers affecting the paracellular barrier. Absorption enhancers are used to allow epi- and endothelial uptake of mid-size and macromolecular solutes, e.g. pharmaceuticals, which are usually hardly resorbed. For this, they open the tight junction transiently. Three different approaches for enhanced absorption were presented. In the first study, a signaling pathway involved in the absorption enhancer-facilitated uptake of local anesthetics at the peripheral blood-nerve-barrier was elucidated resulting in down-regulation of claudin-1. The second study suitable mutations of Clostridium perfringens enterotoxin were used for interaction with several barrier-forming claudins resulting in loss of barrier function. In the third study, effects of the fatty acid salt caprate were analyzed, resulting in tow findings: while the claudin-5 was removed from the bicellular tight junction, tricellulin was removed from the tricellular tight junction. Using fluorescence imaging we further showed that a 607 Da-sized molecule (biotin) was passing the tricellular tight junction after caprate application. From these data hypothesize a novel way of paracellular transport for ions and macromolecules: while ions and small solutes pass the bicellular tight junction in quantitatively relevant amounts through claudin-based paracellular channels, macromolecules pass through the 10 nm big central pore of the tricellular tight junction.