Chiparray basierte Genexpressionsanalysen beim kolorektalen Karzinom nach Laser gestützter Mikrodissektion

Abstract

Die differenzielle Genexpression als Folge der molekularen Alteration in Karzinomen spielt eine entscheidende Rolle für das Verständnis der Tumorbiologie und bildet die Grundlage für die Entdeckung neuer diagnostischer Biomarker und therapeutischer Zielgene. Ziel dieser Arbeit war die Identifikation von differenziell exprimierten Genen (DES) beim kolorektalen Karzinom durch die vergleichende Analyse Chiparray basierter Genexpressionsdaten von korrespondierenden Normal- und Tumorgeweben nach Laser gestützter Mikrodissektion. Zudem wurde die Homogenität der Expression der identifizierten DES innerhalb des Tumorgewebes untersucht, indem definierte Tumorareale mittels Laser gestützter Mikrodissektion getrennt voneinander aufgearbeitet wurden. Des weiteren wurde unter Verwendung der Clusteranalyse untersucht, inwiefern die kolorektalen Tumor- und Normalgewebe anhand der Genexpressionsdaten nach histopathologischen Kriterien klassifiziert werden konnten. Die in dieser Arbeit verwendeten GeneChips von Affymetrix ermöglichten es, die Expression von ca. 33.000 bekannten Genen in den kolorektalen Tumor- und Normalgeweben von 25 Patienten zu messen. Gemäß eines heuristischen Verfahrens wurde eine Rangfolge der detektierten Sequenzen berechnet, anhand derer mittels eines arbiträr gewählten cut-offs 200 DES identifiziert wurden, die in den untersuchten kolorektalen Karzinomgeweben überexprimiert waren, sowie 200 weitere, die unterexprimiert waren. Unter den identifizierten DES fanden sich 42 Gene, die bereits aus der Literatur als im kolorektalen Karzinom differenziell exprimiert bekannt waren, und weitere 43 Gene, die in anderen Tumorentitäten als differenziell exprimiert beschrieben wurden. Der Vergleich der identifizierten DES aus der Tumorinvasionsfront und aus der zentralen Tumorregion ergab eine gemeinsame Schnittmenge von nur ca. 50 % der DES. Die restlichen 50% erfüllten zwar nicht in beiden Tumorarealen die in dieser Arbeit festgelegten heuristischen Kriterien der differenziellen Expression, waren aber dennoch in den unterschiedlichen Tumorregionen ähnlich exprimiert. Die untersuchten kolorektalen Gewebeproben ließen sich anhand ihrer Expressionsprofile in der Clusteranalyse eindeutig einer Tumor- und einer Normalgewebegruppe zuordnen. Es gelang nicht, die untersuchten Gewebeproben anhand ihrer Expressionsprofile in der Clusteranalyse reproduzierbar entsprechend anderer histopathologischer Eigenschaften zu gruppieren. Die Clusteranalysen ergaben zudem, dass die Gewebe unterschiedlicher Tumorareale, der Tumorinvasionsfront (IT) und der zentralen Tumorregionen (RT), keine eigenständigen Gruppen bildeten, sondern die IT und RT Proben des gleichen Patienten innerhalb des Tumorgewebeclusters in den meisten Fällen korrespondierende Dupletts bildeten und somit bezüglich ihrer Genexpression einander ähnlicher waren als im interindividuellen Vergleich. Um die statistische Aussagekraft dieser Arbeit weiter zu stärken, wurde das Patientenkollektiv auf 75 Patienten erweitert. Des weiteren werden einzelne identifizierte DES, wie z.B. Claudin 1, auf RNA- und Proteinebene validiert. Inwiefern die in dieser Arbeit identifizierten DES als neue potenzielle Tumormarker bedeutsam sind oder potenziell therapeutische Zielgene darstellen, muss noch weiter evaluiert werden.

Differential gene expression as a result of molecular alterations in cancer plays an important role for defining new diagnostic biomarkers and treatment targets. Chiparray technology enabling expression analysis of thousands of genes simultaneously has already been successfully applied for the identification of differentially expressed genes (DEGs) in several tumor entities. The aim of this study was to identify DEGs in colorectal cancer by comparing chiparray based expression data from normal and corresponding cancerous epithelium after laser captured microdissection. The intratumor heterogeneity of gene expression was investigated by separating definitive tumor areas using laser captured microdissection. Characteristic expression profiles for pathological parameters were searched by means of cluster analysis. Affymetrix Gene Chips were applied to monitor the gene expression of about 33.000 genes in 25 patients with colorectal cancer. 200 up- and 200 down-regulated genes were identified to be differentially expressed by generating a rank for all detected genes based on statistical tests and an arbitrary chosed cut off. Among those identified DEGs 42 genes were already associated with colorectal cancer and 43 genes with other tumor entities. Nearly 50% of the identified DEGs were differentially expressed in both tumor areas, the central tumor and the invasion front. The other half of the DEGs was similarly expressed in both investigated tumor areas but did not fulfil the defined heuristic criterias of differential expression in this study. Hierarchical cluster analysis clearly discriminated between normal and cancerous colorectal tissues but did not identify reproducible characteristic expression profiles according to pathological parameters like e.g. UICC. Moreover gene expression profiling showed that tissues from different tumor areas of the same patient were stronger related concerning gene expression than the different tumor areas in the interindividual comparison. To support the statistical significance of this study the patient collective has currently been enlarged to 75 patients and selected genes, e.g. Claudin 1, have been validated on RNA and protein level. Whether the identified DEGs encode new potential tumor markers or potential novel therapeutic targets in colorectal cancer has to be further evaluated.