Die Rolle des Helicase-Primase-Komplexes von HErpes-simplex-Virus Typ 1 bei der DNA-Replikation des adenoassoziierten Virus

Abstract

Das adenoassoziierte Virus (AAV) ist ein helferabhängiges Virus, das für seine produktive Vermehrung die Koinfektion mit einem Helfervirus benötigt, z.B. dem Herpes-simplex-Virus (HSV). Als HSV-Helferproteine dienen vier HSV- Replikationsproteine, die zusammen mit dem AAV-Replikationsprotein Rep den Minimalkomplex für die Replikation von AAV bilden. Die vier benötigten HSV- Helferproteine sind das single-strand DNA-binding protein ICP8 und ein trimerer Protein-Komplex mit Helicase- und Primase-Aktivität. Nach Koinfektion von AAV und HSV wird das einzelsträngige AAV-DNA-Genom in subnukleäre HSV- Replikationskompartimente transloziert, in denen das AAV-Genom repliziert werden kann. Hierbei kolokalisieren HSV-ICP8 und AAV-Rep in Gegenwart des einzelsträngigen (ssDNA) AAV-Genoms. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass für die ssDNA-abhängige Rekrutierung von AAV-Rep in nukleäre Replikationskompartimente das Zusammenwirken der vier HSV-Helferproteine hinreichend und notwendig ist. Für die Bildung der nukleären Replikationskomplexe mussten weder die HSV-Helicase noch die HSV-Primase enzymatisch aktiv sein. Dies wurde gezeigt durch Mutanten der HSV-Helicase bzw. -Primase, bei denen gezielt einzelne Aminosäure-Austausche in die katalytischen Zentren eingeführt wurden. Alle Mutanten hatten ihre enzymatische Aktivität vollständig verloren unter Erhalt der Interaktionsfähigkeit als Proteinkomponenten des trimeren Helicase-Primase- Komplexes. Um zu testen, ob während des weiteren Verlaufs der AAV-DNA- Replikation die enzymatische Aktivität von HSV-Primase bzw. -Helicase benötigt wird, wurden AAV-DNAReplikationsanalysen nach Transfektion der vier HSV- Helfergenkonstrukte durchgeführt. Auch hierbei wurden sowohl Helicase als auch Primase vor allem als strukturelle Komponenten der Replikationskomplexe benötigt. Dies entsprach den Erwartungen, da das AAV-ssDNA-Genom an den Enden über partiell doppelsträngige palindromische Strukturen verfügt, die durch komplementäre Rückfaltung die Funktion des Primers für die DNAPolymerase übernehmen. Bei Präsenz der HSV-Polymerase nach HSV-Infektion zeigten die AAV- Replikationsuntersuchungen, dass bei enzymatisch aktiver HSV-Primase AAV effizienter repliziert wird, möglicherweise durch Rekrutierung des HSV- Polymerasekomplexes zur Replikation des AAV-Genoms. 7 Zusammenfassung 111 Die HSV-Helicase besitzt wie AAV-Rep ATPase- und Helicase-Aktivität. Deshalb überraschte der weitere Befund, dass die enzymatisch aktive HSV-Helicase bei Transfektion des minmalen HSV-Replikationskomplexes eine nachweisbare, wenn auch geringe Steigerung der AAV-DNA-Replikationsrate zeigte. Als Erklärung kommt eine Stimulation der homologen Rekombination zur Auflösung hochmolekularer AAV-DNA-Replikationsintermediate in Frage. Aufgrund der entgegengesetzten Polarität der HSV-Helicase könnte diese auch die Rep- Helicase funktionell komplementieren. Die Quantifizierung der AAVReplikationsintermediate zeigte zudem, dass zusätzlich bislang noch unbekannte, weitere HSV- oder zelluläre Faktoren existieren müssen, die die AAV-Replikation weiter stimulieren. Aufbauende Untersuchungen werden nötig sein, um die strukturellen und funktionellen Interaktionen des Multiprotein- Komplexes aus AAV-Rep, HSV-single-strand DNA-binding protein, dem trimeren HSV-Helicase-Primase-Komplex und der AAV-ssDNA zu entschlüsseln. Neben dieser grundlegenden Frage sind die Untersuchungen auch für die Weiterentwicklung der AAV-Vektortechnologie von Bedeutung. Für die weitere Optimierung effizienter Verpackungssysteme für die AAV-Vektorproduktion im biotechnologisch großen Maßstab sind HSV-basierte Systeme äußerst vielversprechend. Deren Weiterentwicklung hängt wesentlich von einem guten Verständnis der Interaktionen zwischen AAV, HSV und zellulären Faktoren während der einzelnen Schritte der AAV-Replikation ab.

The adeno-associated virus (AAV) requires coinfection with a helper virus, such as adenovirus or herpes simplex virus (HSV), for a productive infection. Along with the AAV Rep proteins a subset of DNA replication proteins of herpes simplex virus (HSV) comprising the single-strand DNA-binding protein ICP8 (UL29) and the helicase-primase complex (UL5, UL8, and UL52 proteins) has previously been shown to be sufficient for the replication of adeno-associated virus (AAV). After coinfection, AAV Rep78, HSV-ICP8 and the singlestranded DNA AAV genome form a complex, both in vitro and in vivo the nuclear HSV replication domains. The AAV hairpin-structured terminal repeats (ITRs) serve as primers for AAV DNA replication and the AAV Rep proteins 78 and 68 with its ITR-specific binding and ATPdependent helicase activity is required in trans. In view of these AAV functions, the functional roles of HSV helicase and primase during AAV DNA replication were analyzed in this study. To differentiate between their necessity as structural components of the HSV replication complex or as active enzymes, point mutants within the helicase and primase catalytic domains were analyzed. Confocal microscopy confirmed that in the presence of the minimal four HSV proteins all mutants retained the ability to support formation of ICP8-positive nuclear replication foci, to which AAV Rep 78 colocolized in a manner strictly dependent on the presence of AAV single-stranded DNA. In two complementary approaches the remaining HSV helper functions were either provided by infection with HSV mutants or by plasmid transfections. Upon cotransfection of the minimal four HSV proteins, UL52 primase catalytic activity was not required for AAV DNA replication. In the presence of the total HSV genome after infection, the active primase enhanced the AAV DNA replication. This may be due to recruitment of the HSV polymerase in the replication complex. As well cotransfection of an AAV genome with the minimal set of HSV helper functions as the complementation of a helicase-deleted HSV mutant, the helicase mutants supported a significantly lower level of AAV DNA replication, compared to the wildtype helicase, but clearly higher levels than were observed in the absence of helicase. Whereas the structural role of the helicase was expected, the need for its enzymatic function is not immediately obvious. However, in contrast to the Rep helicase, UL5 is a 5´-3´ helicase, which could complement the function of Rep in the unwinding of the AAV DNA during replication. Further studies will be necessary to clear the structural and functional interactions in the multiple protein complex, composed of the AAV DNA and Rep, the helicase-primase comlex and the single-strand DNA-binding protein ICP8. This knowledge will be useful for the further development and the security of AVV gene technology.