Anwendung eines GL261-Tumormodells in CCR2-defizienten Mäusen

Abstract

Einleitung: Das Glioblastoma multiforme (GBM) gehört zu den niedrig differenzierten Gliomen des zentralen Nervensystems (WHO IV°) mit ausgesprochen schlechter Prognose. Daher ist ein tieferes tumorbiologisches Verständnis dieser Entität notwendig. Die Tumormasse besteht zu einem großen Anteil aus infiltrierenden Mikroglia/Makrophagen (5-20%). Diese werden unter anderem durch CCL2-CCR2 Interaktion bei ausgeprägter Freisetzung von CCL2 aus Tumorzellen rekrutiert. Mikroglia/Makrophagen werden pro-tumorale und pro- angiogene Eigenschaften zugesprochen, die das Wachstumsverhalten der Gliome beeinflussen können. In einem Gliom-Mausmodell wurden daher im Zuge dieser Arbeit die tumorbiologischen Prozesse mit Fokus auf die Rekrutierung und Aktivierung von Mikroglia/Makrophagen anhand von CCR2knock-out (CCR2ko)-Mäusen untersucht. Methoden: Die syngene Tumorzelllinie GL261 wurde stereotaktisch in das Gehirnparenchym von CCR2ko- und C57Bl6/J-Mäusen (Wildtyp) implantiert. Anhand von MRT-Messungen wurden die Tumorvolumina im Verlauf bestimmt (d7, d14, d21) und verglichen. Die Gehirne wurden durch histologische Fixierung aufgearbeitet und sowohl der Phänotyp als auch die Anzahl der infiltrierenden Mikroglia/Makrophagen ermittelt. Die Vaskularisierung wurde anhand einer CD31-Färbung analysiert. Eine weitere Charakterisierung der Immunzellen erfolgte nach Homogenisierung des Hirngewebes. Hierbei wurden vitale Abwehrzellen anhand von Oberflächenmarkern mit Hilfe einer FACS-Analyse untersucht. Mikroglia wurden zudem aus naivem Gewebe via MACS-Technologie isoliert und über mehrere Tage kultiviert. Ergebnisse: Die Analyse der CCR2ko- und der Wildtyp-Mäuse ergab eine ähnliche Ausgangssituation im Gehirn, wobei sowohl die Anzahl der Mikroglia als auch die Gefäßdichte vergleichbar waren. Nach Tumorzellinokulation zeigten sich jedoch eindeutige Unterschiede. Es wurde eine verringerte Akkumulation der Mikroglia/Makrophagen um 30% (p-Wert 0,0018) im Tumorgewebe der CCR2ko-Mäuse detektiert. Diese beruhte auf einer reduzierten Rekrutierung und nicht etwa auf einer verminderten Proliferation oder erhöhten Apoptoserate dieser Zellen. Die FACS-Analyse zeigte die veränderte Immunzellzusammensetzung anhand der Oberflächenmarker CD11b und CD45. Die verbliebenen intratumoralen Mikroglia/Makrophagen in den CCR2ko- Mäusen exprimierten charakteristische monozytäre Marker wie IBA1, CD11b und CD68, sowie Moleküle zur Antigenpräsentation (MHC-I/MHC-II). Die verminderte Anzahl an Mikroglia/Makrophagen im Tumorgewebe der CCR2ko-Tiere ging einher mit signifikant größeren Tumorvolumina (p-Wert 0,0005). Trotz im Mittel verdoppelter Tumorgrößen waren keine Unterschiede in der Gefäßdichte oder -fläche nachzuweisen. Jedoch verdeutlichten detaillierte und differenzierte Untersuchungen der Gefäße eine veränderte Gefäßstruktur. Schlussfolgerung: Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit verdeutlichen den Einfluss des CCL2-CCR2 Signalwegs auf die Mikroglia/Makrophagen-Population und Tumorprogression. So konnte im verwendeten CCR2ko-Modell gezeigt werden, dass die verminderte Rekrutierung von Mikroglia/Makrophagen mit einem verstärkten Gliomwachstum einhergeht. Folglich scheinen Mikroglia/Makrophagen, die unabhängig vom CCL2-CCR2 Signalweg im Tumor akkumulieren, pro-tumorale Eigenschaften zu haben. Die genauere Charakterisierung dieser verbliebenen Mikroglia oder Makrophagen könnte für die Entwicklung zukünftiger Behandlungskonzepte für GBMs von großer Bedeutung sein.

Objective: Glioblastoma multiforme (GBM) belongs to the most malignant glial tumor type (WHO IV°) with poor prognosis. Therefore, more profound tumor- immunological understanding is necessary. Glioma consist of large amounts of infiltrated microglia/macrophages (5-20%). These cells are recruited through chemo-attractants such as CCL2 released to a great extend by tumor cells. Microglia/macrophages presumably possess pro-tumoral and pro-angiogenic properties affecting tumor development. The aim of the study was to analyze possible alterations in tumor biology of CCR2-deficient mice with focus on recruitment and activation of microglia/macrophages during glioma growth. Methods: The glioma cell line (GL261) was stereotactically implanted into the brain parenchyma of transgenic CCR2ko- as well as C57Bl6/J-mice (wildtype). Using MRI-analysis, tumor volumes were measured and compared at specific time points (d7, d14, d21). Brain tissue was prepared and fixed for histological analysis. Here, the amount of infiltrating immune cells and phenotype were determined. Vascularization was assessed via immunohistochemistry performed with CD31-staining. In addition, the characterization of vital immune cells was applied by using Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS). Microglia isolated out of naïve brain tissues via MACS-technology were subsequently cultivated and observed for several days. Results: Analyses of CCR2-deficient and wildtype-mice revealed similar phenotypes in naïve brain tissues when comparing the amount of microglia and the vessel-density within both mice strains. But differences occurred during tumor growth. Accumulation of microglia/macrophages was significantly reduced by up to 30% (p-value 0.0018) due to an impaired recruitment whereby no differences in proliferative activity or rate of apoptosis were displayed. Staining of cells with CD11b- and CD45-antibodies and subsequent FACS-analysis revealed an altered immune cell composition. Remaining microglia/macrophages expressed characteristic monocyte markers (IBA1, CD11b, CD68) and molecules for antigen presentation (MHC-I, MHC-II). The CCR2-deficient mice showed significantly increased tumor volumes (p-value 0.0005) and enhanced proliferative activity of tumor cells despite unchanged vessel-density and -area within tumor tissue. But detailed analyses of the vasculature revealed structural changes, which might be responsible for tumor biological changes. Conclusion: Our data clearly demonstrate the importance of CCL2-CCR2 signaling in the context of microglia/macrophage accumulation and glioma progression. The recruitment of microglia/macrophages into the tumor tissue was significantly diminished affecting tumor biology and enhancing tumor growth. Remaining intratumoral immune cells exhibit signs of pro-tumoral properties. More detailed characterization could make them to interesting targets for future glioma therapies.