Untersuchungen zum Einfluss von 17beta-Estradiol auf die Expression extrazellulärer Matrixgene in Fibroblasten

Abstract

Klinische Daten sowie Studien an Tiermodellen zeigen geschlechterabhängige Unterschiede bei den myokardialen Umbauprozessen innerhalb der extrazellulären Matrix (EZM) während des pathologischen Remodelings. Dabei gaben die Untersuchungen Hinweise darauf, dass das Sexualhormon 17beta-Estradiol (E2) die Expression und Aktivität wichtiger Vertreter der EZM, wie Kollagene und Matrix Metalloproteinasen (MMP), im Herzen reguliert. Um die beobachteten geschlechterabhängigen Unterschiede während des kardialen Remodelings innerhalb der EZM besser zu verstehen, wurde in isolierten kardialen Fibroblasten aus adulten weiblichen und männlichen Ratten untersucht, welchen Einfluss E2 auf die mRNA-Expression der extrazellulären Matrixgene hat. Darüber hinaus wurde untersucht, welchen Einfluss E2 auf die mRNA-Expression der Östrogenrezeptoren (ER) alpha und beta in den kardialen Fibroblasten hat. Die Behandlung der Fibroblasten mit E2 zeigte eine positive Regulation der ER mRNA-Expression in den Zellen der weiblichen und männlichen Ratten. Es konnte gezeigt werden, dass E2 die mRNA-Expression von Kollagen I und III in den Zellen der weiblichen Ratten reduziert. Dagegen kam es in den Fibroblasten der männlichen Ratten, durch die Behandlung mit E2, zu einem Anstieg der mRNA- Expression beider Kollagentypen. Die mRNA-Expression von MMP2 und MMP9 wurde in den kardialen Fibroblasten beider Geschlechter durch E2 reduziert. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, zu klären, über welche Regulationsmechanismen E2 die transkriptionelle Aktivität des MMP2-Gens in Fibroblasten reguliert. Um diese Frage zu beantworten wurden unterschiedlich lange humane MMP2 (hMMP2)-Promotor-Konstrukte gemeinsam mit dem Expressionskonstrukt für ER alpha in humane Fibrosarkom-Zellen (HT1080-Zellen) kotransfiziert. Nach der Transfektion wurden die Zellen mit 10-8M E2 behandelt und mittels Luciferase-Reporter-Assays konnte eine reduzierte Aktivität der hMMP2-Promotor-Konstrukte gemessen werden. Durch die Inkubation der Zellen mit dem E2-Antagonisten ICI konnte die inhibierende Wirkung von E2 aufgehoben werden. Der regulatorische Bereich, in dem E2 in Abhängigkeit von ERalpha seinen Einfluss ausübt, konnte durch die verschiedenen hMMP2-Promotor- Konstrukte eingegrenzt werden. Mit Hilfe von EMSA-Analysen und dem Einsatz spezifischer Antikörper konnte die Bindung des TF Elk-1 innerhalb der eingegrenzten Promotorsequenz nachgewiesen werden. Ebenfalls konnte ein Hinweis auf die Bindung der phosphorylierten Form von Elk-1, nach E2-Behandlung, erbracht werden. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass E2 den TF Elk-1 nicht nur über die ER, sondern auch über die Aktivierung des MAP- Kinase (MAPK)-ERK1/2 Signalweges phosphoryliert und seine inhibierende Wirkung auf die Promotoraktivität des hMMP2-Gens ebenfalls über diesen Signaltransduktionsweg vermittelt. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen erstmals, dass E2 einen regulierenden Einfluss auf die mRNA-Expression der extrazellulären Matrixgene Kollagen I und III sowie MMP2 und MMP9 in kardialen Fibroblasten hat. E2 reguliert dabei die mRNA-Expression von Kollagen I und III geschlechterabhängig und reduzierte die mRNA-Expression von MMP2 und MMP9 in den Fibroblasten beider Geschlechter. Die Expressionsanalysen der hMMP2-Promotor-Konstrukte zeigten, dass der durch E2 aktivierte ER alpha in der Lage ist die Promotoraktivität des hMMP2-Gens zu inhibieren. Dabei vermittelt E2 seinen Effekt anscheinend durch die Phosphorylierung des am hMMP2-Promotor gebundenen TF Elk-1, dessen Phosphorylierung über die Aktivierung des MAPK-ERK1/2 Signalweges realisiert wird.

Clinical and animal studies have shown gender-specific differences in the cardiac remodelling process of the extracellular matrix (ECM) during pathological remodelling. Furthermore, these studies suggest that the sexual hormone 17beta-Estradiol (E2) regulates the expression and activity of important components of the ECM, such as collagens and matrix metalloproteinases (MMP), in the heart. To better understand the described gender differences during ECM remodelling, this study assessed the influence of E2 on the mRNA- expression of ECM genes in isolated cardiac fibroblasts from adult female and male rats. Additionally, the effect of E2 on estrogen receptor (ER) alpha and beta the mRNA-expression was determined. The E2-treatment of cardiac fibroblasts induced the expression of ER alpha and beta genes in the cells of female and male rats. Collagen- type I and III mRNA-expression was decreased in isolated cells of female rats. In contrast, E2-treatment of fibroblasts from male rats revealed an induction in the collagen I and III mRNA-expression. MMP2 and MMP9 mRNA levels were decreased by E2 in the cardiac fibroblasts of both sexes. A further goal was to investigate the mechanism involved in the E2- regulation of the transcriptional activity of the MMP2 gene in fibroblasts. For this purpose, different human MMP2 (hMMP2)-promoter- constructs were co-transfected with the expression construct for the human ER alpha into a human fibrosarcoma cell line (HT1080 cells). Following transfection of the HT1080 cells, they were treated with E2. Luciferase reporter assays showed a significant down- regulation of hMMP2-promoter-activity of every promoter-construct. Pre- treatment with the specific E2-antagonist ICI 182,780 attenuated the inhibitory effect of E2. The regulatory region, responsible for the down- regulation of the hMMP2-promoter-activity by the E2 activated ER alpha, was identified with the aid of the different hMMP2-promoter- constructs. Electrophoretic mobility shift assays (EMSA) and analysis with specific antibodies showed the binding of the transcription factor Elk-1 within the regulatory region. Further EMSAs suggest that the phosphorylated form of Elk-1 binds to the MMP2-promoter after E2- treatment. Elk-1 phosphorylation by E2 was mediated through binding of ER and activating the MAP-Kinase (MAPK)-ERK1/2 signalling pathway. Additional experiments showed that E2 also down-regulates hMMP2- promoter-activity by activating the MAPK-ERK1/2 pathway. In summary, this study shows for the first time a regulation of collagen I and III and MMP2 and MMP9 by E2 in cardiac fibroblasts. E2 regulates mRNA-expression of collagen I and III in a sex-dependent manner and down-regulates MMP2 and MMP9 in cardiac fibroblasts of both sexes. Analysis of the hMMP2-promoter showed a significant down- regulation of the promoter-activity upon E2-treatment and activation of ER alpha. These data suggest that E2 mediates its inhibitory effect by phosphorylating the hMMP2-promoter bound Elk-1, which is by the activation of MAPK-ERK1/2 signalling pathway.