Die Rolle des Cytochrom P450-Systems bei der Resistenz von Wiederkäuernematoden gegen makrozyklische Laktone

Abstract

Medikamente aus der Gruppe der makrozyklischen Laktone (ML) gehören zu den am häufigsten gegen Wiederkäuer-Nematoden eingesetzten Anthelminthika. Prominente Vertreter sind u.a. Ivermectin (IVM) und Moxidectin (MOX). Während der Wirkmechanismus der ML weitgehend aufgeklärt ist, bleibt der Resistenzmechanismus bislang noch unverstanden. Neben unspezifischen Mechanismen wie Efflux-Transportern werden Cytochrom P450 Monooxygenasen (CYPs) als mögliche Resistenzursachen diskutiert. Für Nematoden ist die Nachweislage für die Beteiligung von CYPs am ML-Metabolismus noch spärlich. Allerdings konnte gezeigt werden, dass durch Verwendung des allgemeinen CYP- Inhibitors Piperonylbutoxid (PBO) parasitische Wiederkäuernematoden deutlich empfindlicher gegen ML wurden. Die Identifikation von CYP-Kandidaten von Nematoden, die an der ML-Biotransformation beteiligt sind und somit Basis von Resistenz sein könnten, war Ziel des durchgeführten Projektes. Hierzu wurde primär mit dem Modellnematoden Caenorhabditis elegans gearbeitet, für den aktuell 76 CYPs beschrieben sind. In Entwicklungsassays wurde die Auswirkung von Co-Inkubationen mit ML und PBO auf den C. elegans-N2-Bristol-Wildtyp untersucht, die Ergebnislage erwies sich als widersprüchlich und ließ keine eindeutige Schlussfolgerung zu. In weiteren Entwicklungsassays mit C. elegans- CYP-„loss-of-function“-Stämmen wurden insgesamt 16 Stämme in ihrer Empfindlichkeit gegen definierte Konzentrationen von IVM und MOX mit dem Bristol-N2-Wildtyp verglichen. Der für das cyp-14A5 teildeletierte Stamm VC249 zeigte die am stärksten ausgeprägte Empfindlichkeit, daher wurde das CYP-14A5 als Kandidat für weitere Untersuchungen ausgewählt. Mit auf Grundlage der cyp- 14A-Familie erstellten degenerierten Primern sollten homologe Gene in parasitischen Nematoden PCR-detektiert werden: Dabei wurde sowohl mit cDNA aus nativen Haemonchus contortus, Cooperia oncophora und Ostertagia ostertagi als auch mit cDNA aus mit IVM vorbehandelten C. oncophora Drittlarven gearbeitet; in beiden Ansätzen konnte keine CYP-Sequenz detektiert werden. Ein weiteres Teilprojekt untersuchte den Einfluss der beiden verwendeten ML auf die Expression des cyp-14A5 per quantitativer Real-Time-PCR im C. elegans-Wildtyp. Weder die Vorinkubation mit IVM noch MOX bewirkte eine signifikante Steigerung der cyp-14A5-Expression im Vergleich zum Kontrollansatz. Zur finalen Evaluierung der Auswirkung der cyp-14A5-Deletionsmutation auf die ML- Empfindlichkeit wurde diese vierfach in den C. elegans-Bristol-N2-Wildtyp ausgekreuzt und der so erhaltene Stamm VC249_X4 erneut im Entwicklungsassay untersucht; die in den initialen Versuchen nachgewiesene deutliche Zunahme der Empfindlichkeit konnte nicht reproduziert werden. In einer abschließenden Untersuchung sollte die Fähigkeit zum ML-Stoffwechsel von parasitischen Nematoden mit Hilfe von massenspektrometrischen Analysen untersucht werden. In C. oncophora Drittlarven konnten keine IVM- oder MOX-Metabolite gefunden werden.

Macrocyclic lactones (ML) are widely used anthelmintics for the treatment of nematode infections in ruminants. While the mode of action is well known, the mechanism of resistance still remains unclear. Beside unspecific mechanisms such as drug efflux pumps (e.g. P-glycoproteins), cytochrome P450 monooxygenases (CYPs) have been discussed to cause ML-resistance. In previous in vitro experiments it was shown that inhibition of CYPs using piperonyl butoxide (PBO) in the parasitic nematodes Cooperia oncophora and Ostertagia ostertagi results in increased susceptibility of the parasites against ML. The current doctoral thesis has aimed to identify CYP-candidates in nematodes which are involved in biotransformation of ML and could therefore potentially confer resistance. Caenorhabditis elegans was used as a model for parasitic nematodes due to its easy maintenance in the lab, the availability of a broad methodical spectrum and the wide knowledge about its biology. Its genome encodes 76 CYPs and for several CYP-genes mutated loss-of-function-strains are available. As ML of choice Ivermectin (IVM) and Moxidectin (MOX) were used for the studies. Development assays were performed to examine the influence of PBO on the susceptibility of the C. elegans-Bristol-N2-wildtype against IVM and MOX. The results were inconsistent; no clear conclusion could be achieved. Further development assays were performed to compare the susceptibility of 16 C. elegans-CYP-loss-of-function-strains against IVM and MOX with the susceptibility of the wildtype. The screening revealed the VC249-strain (deficient for CYP-14A5) as an interesting candidate due to its highly increased susceptibility against both ML. Based on the cyp-14A-family of C. elegans degenerated primers were designed for the detection of cyp-14A- homologous genes in parasitic nematodes. cDNAs from naïve Haemonchus contortus, Cooperia oncophora und Ostertagia ostertagi as well as cDNA from IVM-induced C. oncophora third larval stages (L3) were used, but no cyp- sequences were amplified in any of the trials. In another sub-project, the influence of IVM and MOX on the expression of the cyp-14A5-gene in the C. elegans-wildtype was evaluated via quantitative real-time-PCR. Neither the incubation with non-lethal concentrations of IVM nor MOX resulted in a significantly changed expression of the cyp-14A5-gene. For a final evaluation of the influence of the cyp-14A5-gen-deletion on the susceptibility of C. elegans against ML, the mutation was fourfold outcrossed into the wildtype. The resulting strain VC249_X4 underwent further analysis in development assays, but the initially observed increased susceptibility against ML was not reproducible. In a final trial, the ability of C. oncophora L3 to metabolize IVM and MOX was examined via mass spectrometry in a “non-targeted metabolomics”-approach. A range of metabolite candidates were designed, but none of them was found in the nematodes.