Identifizierung post-translationaler Modifikationen mittels Peptid Mikroarrays

Abstract

Multiplex Technologien rücken immer mehr in den Fokus der Wissenschaft und klinischen Forschung. Diese Technologien wie bspw. Mikroarrays oder Bead basierte Systeme erlauben es hunderte oder tausende Nachweise in einem Experiment durchzuführen und dadurch Zeit, Kosten und Probenvolumen zu sparen. Ziel dieser Arbeit war es ein Tool zu entwickeln, welches das schnelle Screening nach Phosphorylierungsstellen auf Multiplexing Plattformen erlaubt und erweiterbar ist für weitere post-translationale Modifikationen. Als Modell System wurden hierbei die Membranproteine TRPV1 und ARMS als Target der Proteinkinase A (PKA-Cα) verwendet. Um einen detaillierten Einblick in die biochemischen Grundlagen chronischer Schmerzen zu erhalten, wurde ein Tool entwickelt, welches speziell Phosphorylierungen an primären Schmerztargets mit Hilfe eines anti-pPKA Antikörpers detektiert. Basierend auf einer Literaturrecherche wurde der cytosolische Teil von ausgewählten Membranproteinen (ARMS, ACI, ACV, ACVIII, MOR, DOR, TRPVI) nach Ser/Thr Phosphorylierungsstellen untersucht und Peptide (~30 AS) designend, welche die potentielle Phosphorylierungsstelle mittig beinhalteten. Die Ergebnisse zeigen, dass der anti-pPKA Antikörper nicht nur die Bindestelle RRxpS/T bindet, sondern auch RKpS/T und abgeschwächt auch Lysinmotive. Nach Optimierungen der Peptid Mikroarray Herstellung und des Assayprotokolls konnte eine Intra-/Interslide Reproduzierbarkeit der Peptid Mikroarrays von ca. 0,9 erreicht werden. Nach der Etablierung des Kinaseassays auf zwei Multiplexing Plattformen, DotBlot und TLC, wurde 186 Peptide nach potentiellen Phosphorylierungsstellen der PKA-Cα analysiert. Mit Hilfe des Peptid Mikroarrays konnten dabei 11 Peptide als Targets der PKA-Cα identifiziert werden, welche durch die Zeit-aufgelöste Analyse auf dem BioPlex3D verifiziert werden konnten. Es war möglich eine Einteilung der Peptide in major und minor Targets der PKA-Cα vorzunehmen. Fünf der 11 Phosphorylierungsstellen wurden dabei erstmals mit in vitro Methoden detektiert. Wie an Hand des TRPVI/ARMS/PKA Interaktions-Modell gezeigt, können die detektierten P-Stellen in biologische Modelle implementiert werden. Sie helfen herauszufinden wie Proteine interagieren und welche Stellen im cytosolischen Bereich dabei eine entscheidende Rolle spielen.

Multiplexing technologies are gaining more and more attention in the life science area. These technologies like microarray or bead based systems allow the detection of hundred or even thousands of reactions in one experiment. With this opportunity it is possible to save time, costs and sample volume, which is important in case of patient samples for example. Regarding to this the aim of this work was to set up a fast screening tool for phosphorylation sites on multiplexing platforms with the potential to be extended to other post-translational modifications. As a model system chronic pain with a focus on ARMS and PKA is used. To get a closer look into the protein network I set up a tool, to especially look for the phosphorylation sites of kinases on primary pain targets by making use of an anti-pPKA Antibody. Therefor I did a computer based sequence analysis for Ser/Thr phosphorylation sites (p-sites) on the cytosolic part of pre-selected human membrane proteins (ARMS, ACI, ACV, ACVIII, MOR, DOR, TRPVI) and designed peptides (30aa) with a midterm possible phosphorylation sites. The results clearly show that the anti-pPKA antibody is not only binding to the RRxpS/T recognition sites, but also RKxpS and in a weakened form Lysine binding sites. After optimizing the spotting procedure of the peptides (e.g. concentration, spotting conditions) and the assay protocol (e.g. washing and blocking steps, antibody concentration) the Intra-and Interslide reproducibility lies around 0,90. After the establishment of the assay on two independent multiplexing platforms (peptide microarrays and a Bead based system), as well as DotBlot and TLC, 186 peptides were screened for PKA-Cα target sites. By using peptide microarrays 11 peptides were identified as targets for the Proteinkinase A, which were verified with a time-resolved analysis on the BioPlex3D. Five of the 11 detected p-sites were detected for the first time using in vitro methods. Due to the time-resolved analysis it was possible to group the peptides as major and minor target sites for the PKA-Cα. As shown with the TRPVI/ARMS/PKA interaction model the identified p-sites can be implemented into biological models and can help to discover how several proteins interact and which sites of the cytosolic part may play a major role.