Analysis of the dystrophin interactome

Abstract

The aim of this project was to systematically identify new interaction partners of the dystrophin protein within differentiated human skeletal muscle cells in order to uncover new roles in which dystrophin is involved, and to better understand how the global interactome is affected by the absence of dystrophin. A more complete understanding of the interactors and roles of dystrophin is vital for increasing the understanding of pathology in patients of Duchenne and Becker muscular dystrophy and other diseases in which dystrophin or dystrophin associated proteins are affected, and will assist in the development and research of treatments aimed at re-establishing the important interactions and pathways that have been lost or disrupted. Initially, a review of existing literature and bioinformatics resources was carried out and used as the basis of an online interactome of dystrophin’s physical interactors. A SILAC-based proteomics approach was then used to identify new interaction partners that were added to this bioinformatics resource. To obtain high protein quantities to maximize sensitivity we required a large number of cells, only feasible though the use of immortalized cell lines. hTERT/cdk4 immortalized myogenic human cell lines represent an important tool for skeletal muscle research however, disruption of the cell cycle has the potential to affect many other cellular processes to which it also linked. We carried out a transcriptome-wide analysis of healthy and diseased lines comparing immortalized lines with their parent primary populations in both differentiated and undifferentiated states in order to test their myogenic character by comparison with non-myogenic cells. We found that immortalization has no measurable effect on the myogenic cascade or on any other cellular processes, and that it was protective against the senescence process - a process observed at higher division counts of primary cells. Selected lines were not aneuploid and did not present any chromosomal rearrangements. In this context the human muscle cell lines are a good in vitro model to study the dystrophin interactome. Having validated our cell lines, we investigated dystrophin’s interactors using a high-sensitivity proteomics approach incorporating (1) isotopic amino acid labelling (SILAC), (2) knockdown of dystrophin expression, (3) immunoprecipitation and (4) mass spectrometry, allowing for the confident identification of dystrophin interactors, eliminating the multitude of false positive proteins pulled down through unspecific binding to both the beads and the antibody. We identified 18 new physical interactors of dystrophin which displayed a high proportion of vesicle transport related proteins and adhesion proteins, strengthening the link between dystrophin and these roles. The proteins determined through previously published data together with the newly identified interactors were incorporated into a web-based data exploration tool: sys-myo.rhcloud.com /dystrophin-interactome, intended to provide an easily accessible and informative view of dystrophins interactions in skeletal muscle. This tool will benefit future understanding and interpretation of the interaction data, by placing these newly identified physically interacting proteins within the mechanistic context of the wider dystrophin interactome.

Ziel dieses Projektes war die systematische Aufdeckung neuer Interaktionspartner des Dystrophin-Proteins in differenzierten Skelettmuskelzellen, um neue Funktionen von Dystrophin zu identifizieren und ein eingehenderes Verständnis darüber zu erlangen, welche Auswirkungen das Fehlen von Dystrophin auf das Interaktom insgesamt hat. Eine umfassendere Kenntnis der Wechselspieler und Funktionen von Dystrophin ist entscheidend für ein besseres Verständnis des Krankheitsgeschehens bei Patienten mit Muskeldystrophie vom Typ Duchenne oder Becker und anderer Krankheiten, bei denen Dystrophin oder Dystrophin-assoziierte Proteine beeinträchtigt sind, und wird zur Entwicklung und Erforschung von Therapien beitragen, die auf eine Wiederherstellung fehlender bzw. gestörter fundamentaler Interaktionen und Signalwege abzielen. Zunächst wurde eine Recherche in der vorhandenen Fachliteratur und in Bioinformatik-Ressourcen durchgeführt und als Grundlage für ein Online-Interaktom der physischen Wechselspieler von Dystrophin verwendet. Anschließend wurden mithilfe der in der Proteomik gängigen SILAC- Technik neue Interaktionspartner identifiziert und dieser Bioinformatik- Ressource hinzugefügt. Um im Sinne einer Maximierung der Empfindlichkeit hohe Proteinmengen zu erhalten, benötigten wir eine große Anzahl von Zellen, was nur durch Verwendung immortalisierter Zelllinien möglich war. Immortalisierte myogene Humanzelllinien vom Typ hTERT/cdk4 sind ein wichtiges Hilfsmittel in der Skelettmuskelforschung, allerdings könnten durch die Unterbrechung des Zellzyklus zahlreiche andere zelluläre Prozesse beeinflusst sein, mit denen der Zellzyklus verknüpft ist. Wir führten eine Transkriptom-weite Analyse gesunder Zelllinien und krankheitsspezifischer Zelllinien durch, indem wir immortalisierte Zelllinien mit ihren Primärzell-Elternpopulationen sowohl im differenzierten als auch im undifferenzierten Zustand verglichen, um ihren myogenen Charakter durch Vergleich mit nicht-myogenen Zellen zu prüfen. Bestimmte Zelllinien wurden außerdem im Hinblick auf Aneuploidie und chromosomale Rearrangements überprüft. Wir stellten fest, dass Immortalisierung keine messbaren Auswirkungen auf die myogene Signalkaskase oder auf andere zelluläre Prozesse hatte und dass sie vor den systemischen Auswirkungen von Seneszenz, die nach einer großen Zahl von Teilungen von Primärzellen zu beobachten sind, schützte. Nachdem wir unsere Zelllinien validiert hatten, untersuchten wir Dystrophin-Wechselspieler im Rahmen eines hochempfindlichen Proteomik-Ansatzes mit Knockdown, Isotopenmarkierung von Aminosäuren (SILAC), Knockdown der Dystrophin-Expression, Immunpräzipitation und Massenspektrometrie. Dies ermöglichte eine zuverlässige Identifizierung von Dystrophin-Wechselspielern unter Eliminierung der Präzipitation der zahlreichen falschpositiven Proteine infolge einer unspezifischen Bindung an die Beads und den Antikörper. Wir identifizierten 18 neue physische Wechselspieler von Dystrophin, darunter anteilsmäßig viele Proteine, die am Vesikeltransport beteiligt sind, sowie Adhäsionsproteine, was die Verknüpfung zwischen Dystrophin und diesen Funktionen untermauert. Die aus publizierten Daten ermittelten Proteine sowie die neu identifizierten Wechselspieler wurden in ein internetbasiertes Datenexplorationstool (sys-myo.rhcloud.com /dystrophin-interactome) eingegeben, um eine übersichtliche und informative Darstellung der Dystrophin-Interaktionen im Skelettmuskel zu erhalten. Dieses Tool wird künftig dem Verständnis und der Interpretation der Interaktionsdaten dienlich sein, indem es diese neu identifizierten physisch interagierenden Proteine in den Kontext des größeren Dystrophin-Interaktoms einbindet.