Development of a miniaturised platform for PCR based assays with application in gene expression analysis and SNP genotyping

Abstract

Functional genomics tries to understand the information encoded in the genome and its complex network organization. Thereby gene expression analysis and SNP genotyping are central elements of a functional genome analysis. Due to genome complexity, capable analysis methods with high-throughput capability are required in genomics. Limitations of available high-throughput methods such as microarrays are their relatively low sensitivity and reduced fexibility in assay design. This work aimed at developing a miniaturized high-density micro- well plate platform for liquid PCR-based assays to combine the high density of a miniaturized array format with the features of liquid PCR-based methods. With the polypropylene-based µPCR chip a cost-effective substrate for highly parallel PCR-based analysis was developed. The developed formats of the µPCR chip were verified to permit PCR-based assays in a volume range of 200 to 18 nl. Real-time PCR-based expression analysis was performed with the 5'-exonuclease assay (TaqMan). For reliable quantification down to 50 nl a workflow with advanced non-contact nanoliter liquid handling, efficient sealing, precise thermocycling and capable signal readout as well as data analysis procedures was developed. The platform demonstrated good reproducibility and high sensitivity down to single molecules in nanoliter volumes. The results of 200 nl assays in a study of tissue-specific gene expression in mouse were consistent with those obtained for 10 µl assays. Successful TaqMan-based SNP genotyping was performed down to 100 nl. For the analysis a robust allele-calling algorithm was developed. Due to the high sensitivity of the system, reliable genotyping was shown down to 5 initial target molecules of human genomic DNA as well as the equivalent amount of whole genome amplified DNA. In a validation study of 60 patients vs. 16 SNPs per chip, high concordance rates to the results obtained from conventional volumes were achieved. The newly developed µPCR chip platform proved to be a capable technology for miniaturized PCR-based analyzes in functional genomics. With the reduction of assay volumes down to few nanoliters the µPCR chip platform enables comprehensive large-scale studies in gene expression as well as SNP genotyping fine-mapping requiring only a moderate consumption of biological and financial resources.

Die funktionelle Genomanalyse untersucht den Zusammenhang zwischen der im Genom codierten Information und deren AusprÄagung im Organismus. Dabei nehmen die Genexpressionsanalyse und die Genotypisierung von 'Single Nucleotide Polymorphismen'(SNP) als häufigste Form genetischer Variabilität eine zentrale Stellung ein. Durch die Komplexität des Genoms werden für die umfassende Analyse leistungsfähige Methoden benötigt, die hoch parallel arbeiten oder im Hochdurchsatz durchgeführt werden können. Vorhandene Methoden wie zum Beispiel die Microarray Technologie sind dabei oft durch geringe Sensitivität oder wenig Flexibilität in der Versuchsgestaltung begrenzt. Ziel dieser Arbeit war es, eine miniaturisierte Plattform für die Anwendung von flüssigen PCR- basierten Methoden zu entwickeln. Damit sollten die Vorteile einer sehr dichten Anordnung von Reaktionsgefäßen mit den Stärken PCR-basierter Methoden kombiniert werden. Mit dem aus Polypropylän hergestellten µPCR Chip wurde ein kosteneffektives Substrat für die hochgradig parallelisierte Analyse mit PCR- basierten Methoden entwickelt. Die verschieden Formate des µPCR Chip ermöglichen erfolgreiche PCR-Amplifikationen in Volumina zwischen 200 und 18 nl. Für die Genexpressionsanalyse wurde der 5'-Exonuklease Assay (TaqMan) als die geeigneteste Methode identifiziert, mit der die zuverlässige Quantifizierung bis zu einem Volumen von 50 nl erreicht wurde. Zur Durchführung der Analyse wurde leistungsfähiges Nanoliter-Handling, eine effektive Lösung zum Schließen der Reaktionsgefäße, Einrichtungen für die präzise thermische Prozessierung und eine leistungsfähige Detektion mit anschließender Datenalyse entwickelt. Neben einer guten Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zeigte die Plattform eine hohe Sensitivität bis zu einzelnen Molekülen. In einer Validierungsstudie über gewebsspezifische Genexpression in Maus konnten mit 200 nl Reaktionen konsistente Ergebnisse zu den Ergebnissen in 10 µl gezeigt werden. Die erfolgreiche SNP Genotypisierung wurde ebenfalls mit dem 5'-Exonuklease Assay durchgeführt. Für die entwickelte Detektionsplattform wurde ein robuster Algorithmus zur Identifizierung der Allel-Information erarbeitet, der eine Reduktion des Reaktionsvolumens bis auf 100 nl ermöglichte. Durch die hohe Sensitivität der Plattform konnte bis zu einer Anfangsmenge von 5 DNA Molekülen genotypisiert werden. In einer Validierungsstudie mit 60 Patientenproben und 16 SNPs pro µPCR Chip wurde eine hohe Übereinstimmung zu den Ergebnissen aus konventionellen Reaktionsvolumina gezeigt. Mit der neu entwickelten µPCR Chip Plattform wurde eine leistungsfähige Technologie für miniaturisierte PCR-basierte Methoden in der Funktionellen Genomanalyse entwickelt. Durch die Reduktion des Reaktionsvolumens auf wenige Nanoliter werden großangelegte Genexpressionsstudien oder SNP Genotypisierungsstudien bei moderater Inanspruchnahme biologischer und finanzieller Ressourcen ermöglicht.