Nachweis hoher Frequenzen zirkulierender Melanom-reaktiver CD8+ T-Zellen bei Patienten mit fortgeschrittenem Melanom

Abstract

Es gibt zahlreiche Untersuchungen, die für die Existenz spezifischer T-Zellen gegen TAAs bei Tumorpatienten sprechen. In den meisten Studien wurden die Tumor-reaktiven T-Zellen dabei aus Tumorgewebe oder dem peripheren Blut expandiert. Bisher ist noch wenig über ihre tatsächliche Funktion "in-vivo" bekannt, unter anderem weil viele Analysen nach "in-vitro"-Stimulation durchgeführt wurden, die zu quantitativen und qualitativen Veränderungen der Tumor-reaktiven T-Zellen führen. In dieser Arbeit gelang die Etablierung eines ELISPOT-Assays zum direkten "ex-vivo"-Nachweis tumorreaktiver T-Zellen. Dabei untersuchte ich zunächst die Eignung allogener, in bestimmten HLA-Merkmalen übereinstimmender Tumorzellen als Zielstrukturen im ELISPOT Assay, welche die Analyse eines breiten Antigenspektrums bieten. Um zu bestimmen, ob zirkulierende Tumor-reaktive T-Zellen im peripheren Blut nachweisbar sind, wurden dann unstimulierte T-Zellen von Melanompatienten und von einem gesunden Normalkollektiv mittels IFNg -ELISPOT-Assays auf die Erkennung von HLA-A2 oder A1-identen Melanomzellinien getestet. Die Untersuchung des gesunden Normalkollektives ergab keine oder nur eine niederfrequente T-Zell-Antwort gegen die allogenen HLA-A1- bzw. HLA-A2-identen Tumorzelllinien. Elf von 19 Patienten mit metastasiertem Melanom zeigten eine T-Zell-Antwort mit Frequenzen von 0,04% bis 0,81% der PBMCs, die IFNg nach Kontakt mit verschiedenen HLA-A2 oder A1-identen Melanomzelllinien freisetzten. Diese T -Zell-Antworten wurden von CD8+ T-Zellen vermittelt und konnten bei HLA-A2+ Patienten durch einen anti-HLA-A2-Antikörper spezifisch blockiert werden. Zur näheren Charakterisierung wurden bei einem Patienten CD8+ T-Zellen in (CD8+/CD45RA+)- und (CD8+/CD45R0+)-Subpopulationen aufgetrennt und im ELISPOT- Assay getestet. Tumor-reaktive T-Zellen konnten sowohl im CD8+ Effektor-T-Zell- (CD45RA+/IFNg +) als auch im CD8+ Gedächtnis-T-Zell- Kompartiment (CD45RO+/ IFNg +) nachgewiesen werden. Zudem waren diese Tumor- reaktiven T-Zellen zur Granzyme-B-Freisetzung in der Lage, als Hinweis darauf, dass sie "in-vivo" direkte zytotoxische Funktion ausüben können. Bei drei von fünf Patienten, bei denen zusätzlich autologe Tumorzellen zur Verfügung standen, konnten ähnliche T-Zell-Frequenzen wie gegen die allogenen HLA-A1 oder A2- identen auch gegen die autologen Tumorzelllinien beobachtet werden. Zwei dieser Patienten zeigten allerdings nur eine Antwort entweder gegen die autologe oder gegen die allogenen Tumorzelllinien. Dies kann als Hinweis auf die Erkennung privater Antigene bzw. auf das Vorliegen von Tumor-Escape- Mechanismen gewertet werden. Auch wenn der Vergleich von autologen und allogegenen Tumorzelllinien keine 100% Übereinstimmung ergab, bestätigten diese Ergebnisse die grundsätzliche Eignung des ELISPOT-Assays mit allogenen Melanomzelllinien als Zielstrukturen. Insgesamt gelang in der vorliegenden Arbeit der Nachweis von Tumor-reaktiven CD8+ T-Zellen bei mehr als der Hälfte der untersuchten Melanompatienten. Dabei sind die Tumor-reaktiven T-Zellen womöglich z.T. gegen bisher nicht definierte Antigene gerichtet. Einige der Patienten, bei denen Tumor-reaktive T-Zellen nachgewiesen wurden, zeigten klinische Hinweise für eine möglicherweise immunologisch-vermittelte Tumor- Kontrolle. Andererseits hatten viele Patienten progredient wachsende Tumoren, denen Tumor-Escape-Mechanismen zugrunde liegen könnten.

To determine whether circulating tumor-reactive T cells are present in melanoma patients, unstimulated T cells from peripheral blood were tested for recognition of HLA-A2- or HLA?A1-matched melanoma cell lines using the ELISPOT assay. Eleven out of nineteen patients with metastatic melanoma had a T cell response with up to 0.81%, 0.78%, 0.53%, 0.12%, 0.10%, 0.09%, 0.07%, 0.06%, 0.06%, 0.04% and 0.04% of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) secreting IFN gamma upon exposure to various HLA-A2- or HLA-A1-matched melanoma cell lines. These T cell responses were mediated by CD8+ T cells and could specifically be blocked by an anti-HLA-A2 antibody in HLA-A2-positive patients. Separation experiments performed in one melanoma patient showed tumor-reactive T cells in both the CD8+ effector T cell (CD45RA+/IFN gamma+) as well as the CD8+ memory T cell compartment (CD45RO+/IFN gamma+). In 3 out of 5 patients, in whom autologous cell lines were available, similar frequencies of T cells in response to HLA-A1- or HLA-A2-matched allogeneic and autologous tumor cells were observed, while 2 patients had a T cell response restricted to either the autologous or the allogeneic cell lines. These results give evidence for the presence of tumor-reactive CD8+ T cells in more than half of melanoma patients tested. Although some of these patients have clinical evidence for an immunological mediated tumor control several patients have growing tumors suggesting presence of escape mechanisms.