Visualisierung des Zelltodes im Schlaganfallmodell der Maus

Abstract

Der thrombotische oder thromboembolische Verschluss eines gehirnversorgenden Gefäßes führt zu einer kritischen Reduktion des zerebralen Blutflusses und somit konsekutiv zum ischämischen Schlaganfall. Direkte Schäden und komplexe Schadenskaskaden führen zum Absterben von Zellen zunächst im Schlaganfallkern und folgend in der Penumbra ("tissue at risk"). Geeignete Therapiemaßnahmen (z. B. Thrombolyse) können eine Ausdehnung des Schadens vom Schlaganfallkern in die Penumbra hinein aufhalten. Mit dem "PWI/DWI-mismatch" der MRT lässt sich die Penumbra derzeit nur mit unzureichender Genauigkeit erfassen. Ein spezifischer Marker zur nicht-invasiven Detektion von geschädigten bzw. toten Zellen wird noch nicht in der Klinik eingesetzt. Annexin A5 (Ax5) hat eine hohe Affinität für Phosphatidylserine (PS), welche sich bei intakten Zellen überwiegend an der Innenseite der Zellmembran befinden. Bei Nekrose und beim programmierten Zelltod ist PS exponiert und damit durch Ax5 markierbar. Von einer nicht-invasiven molekularen Bildgebung des Zelltodes beim ischämischen Schlaganfall verspricht man sich in Kombination mit CT oder MRT eine genauere Abgrenzung der Penumbra, wodurch mehr Patienten von einer Thrombolyse nach Ablauf des 4,5 Stunden Zeitfensters profitieren könnten als bisher (nur ca. 6 % der Patienten). Zudem kann die Einführung eines spezifischen molekularen Markers für den Gewebeschaden beim ischämischen Schlaganfall einen wichtigen Beitrag zu einem verbesserten Verständnis der Pathophysiologie der Erkrankung leisten. In dieser Arbeit wurde die Eignung von Ax5 zur nicht-invasiven Detektion geschädigter Zellen beim ischämischen Schlaganfall im Tiermodell überprüft. Hierzu wurde Ax5 mit einem nah-infrarot Fluoreszenz (NIRF) Farbstoff (Cy5.5) markiert und dessen Verteilung im Vergleich zu anderen Schadensmarkern (Propidiumiodid und TUNEL-Färbung) bei Mäusen nach Okklusion der Arteria cerebri media (MCAO-Modell) untersucht. Cy5.5-Ax5 wurde den Versuchstieren 48 Stunden nach der Okklusion i.v. injiziert. Nach 4 bzw. 8 Stunden Zirkulationszeit wurden nicht-invasive NIRF-Aufnahmen vom Kopf der Mäuse und ex-vivo Aufnahmen vom Gehirn sowie von Gehirnschnitten angefertigt. Als Kontrolle für unspezifische Bindungen von Ax5 wurde einer Versuchstiergruppe inaktives Cy5.5-Ax5 injiziert, das nicht an PS bindet. Die Ergebnisse zeigen, dass sich 4 und 8 Stunden nach Injektion von aktivem, nicht aber nach Injektion von inaktivem Ax5 im MCAO-Modell der Maus mit nicht- invasiver NIRF-Bildgebung über der ipsilateralen Hemisphäre signifikant höhere Fluoreszenzintensitäten, als über der kontralateralen Seite nachweisen ließen. Auf den ex-vivo Aufnahmen der Gehirne und der Gehirnschnitte war eine geringe, aber messbare Anreicherung auch von inaktivem Ax5 im Schlaganfallgewebe zu verzeichnen, die auf eine unspezifische Aufnahme von aktivem Ax5 ins ischämische Gewebe aufgrund der Störung der Blut-Hirn-Schranke im Schlaganfallgewebe hinweist. Das inaktive Ax5-Signal war jedoch so gering, dass es nicht-invasiv nicht messbar war. Auch zeigte sich eine hohe unspezifische Anreicherung von Ax5 im venösen System des Gehirns (Confluens sinuum, Sinus sagittalis). Die histologischen Untersuchungen zeigten eine gute Kolokalisation von Ax5 mit Propidiumiodid und TUNEL-Färbung, jedoch auch eine offensichtlich unspezifische Bindung von aktivem Ax5 an die Ependymzellen der ipsi- und kontralateralen Ventrikel. Diese Arbeit zeigt erfolgreich die nicht- invasive Visualisierung von Zelltod beim ischämischen Schlaganfall im Kleintier mit Cy5.5 markiertem Ax5. Eine hohe Spezifität von Ax5 für geschädigte Zellen im Schlaganfallgewebe konnte nachgewiesen werden. Jedoch wurden auch unspezifische Bindungen festgestellt. Klinische Studien an Schlaganfallpatienten mit radioaktiv markiertem Ax5 und SPECT-Bildgebung zeigen, dass Ax5 potentiell am Patienten zur Visualisierung von geschädigtem Gewebe einsetzbar ist. Allerdings bedarf es weiterer klinischer Studien mit mehr Patienten, um den Nutzen der Methode in der Diagnostik und Therapie von Schlaganfallpatienten nachzuweisen.

To monitor stroke-induced brain damage and to assess neuroprotective therapies, specific imaging of cell death after cerebral ischemia in a non- invasive manner is highly desirable. Annexin V has been evaluated as a marker for imaging dead or lethally damaged cells under various disease conditions, including stroke patients. In this study, mice were subjected to middle cerebral artery occlusion (MCAO) and injected intravenously with either active or inactive Cy5.5-annexin V as a control 48 h after reperfusion. A fraction of the mice also received propidium iodide (PI), a marker for cell integrity. In MCAO mice receiving active Cy5.5-annexin V, but not in those injected with inactive Cy5.5-annexin V, significantly higher fluorescence intensities over the hemisphere ipsilateral to MCAO compared with the contralateral side were detected non-invasively in-vivo as well as ex-vivo in NIRF images of the removed brains and brain sections 4 and 8 h after Cy5.5-annexin V injection. The vast majority of cells positive for fluorescent annexin V were also positive for PI and fragmented DNA as detected by TUNEL-staining. This study demonstrates the high specificity of annexin V for visualization of dead or lethally damaged brain cells in-vivo in a mouse model of focal cerebral ischemia. To our knowledge, this is the first study to compare the distribution of intravenously injected active as well as inactive annexin V, PI, and subsequent TUNEL-staining, providing the basis for an experimental as well as clinical application of annexin V-targeted brain imaging after stroke.