Co-Expression of insulin-like growth factor-1 and interleukin-4 in an in vitro canine chondrocyte and mesenchymal stem cell model

Abstract

Osteoarthritis (OA) is a degenerative as well as inflammatory disease caused by an imbalance between both catabolic and anabolic factors, affecting both humans and canines alike. The main catabolic mediators, interleukin (IL) -1β and tumor necrosis factor α (TNFα), propagate the expression of other inflammatory mediators that are involved in the degradation of cartilage matrix proteins and ultimately the loss of cartilage. To combat inflammation and at the same time stimulate cartilage matrix synthesis, the presence of both anti-inflammatory and growth factor genes from the same species are needed. Currently there is no cure for OA. However, regenerative medicine coupled with gene therapy offers a good alternative in the treatment of arthritis, with more focus on co-expressing two genes to battle the disease processes. This study focuses on the effects of the co-expression of insulin- like growth factor-1 (IGF-1), and the anti-inflammatory cytokine, IL-4, on cartilage degrading and synthesizing factors in an in vitro canine chondrocyte and mesenchymal stem cell (MSC) model. Regenerative and anti-inflammatory effects of IGF-1 and IGF-1/IL-4 in an in-vitro chondrocyte inflammatory model were analyzed. Co-expression of the transgenes was ascertained by immunoassay. Pro-inflammatory mediators like IL-1β, TNFα, matrix metalleoproteinases (MMPs), inducible nitric oxide synthase (iNOS), as well as IGF-binding proteins (IGFBPs), were analyzed by real-time qRT-PCR. The regeneration of extracellular matrix proteins was demonstrated on the mRNA and protein levels. Canine MSCs were isolated and characterized based on morphological as well as biochemical features utilizing real-time qRT-PCR, FACS, and immunocytochemistry. The stem cells were transfected with IGF-1/IL-4 to test the chondrogenic potential of IGF-1 compared to chondrogenic medium containing TGFβ3. Stable cells with the inflammatory sensitive pCOX2-IL-4 were super- transfected with pVitro2-IGF-1. Co-cultures with stably transfected cells and chondrocytes or MSCs were analyzed on their ability to produce extracellular matrix protein type II collagen and to reduce the expression of the collagen degradative mediator MMP-13. Results from the chondrocyte pro-inflammatory model show that pro-inflammatory mediators as well as IGFBPs were down- regulated in samples transfected with IGF-1/IL-4 to levels comparable to the non-stimulated, non-transfected control. Also, those samples as well as samples transfected with IGF-1 alone showed signs of regeneration denoted by the expression of aggrecan, type II collagen and SOX9. Canine MSCs were shown to undergo chondrogenesis utilizing chondrogenic medium with TGFβ3 as well as by transfecting them with IGF-1/IL-4. In both situations, chondrogenesis was proven by the expression of cartilage markers, namely aggrecan and type II collagen. Hypertrophy marker, type X collagen, was seen in the 2nd week of cultivation with TGFβ3. Co-cultures with stably transfected cells also demonstrated an up-regulation of type II collagen and a down-regulation of MMP-13 under pro-inflammatory conditions. Overall, this study shows the ability of the combined expression of IGF-1 and IL 4 to stimulate proteoglycan and type II collagen synthesis and to down-regulate the degradative effects of IL-1β and TNFα, in chondrocyte and co-culture models. Co-expression of therapeutic genes in MSCs offers a dual role in stimulating differentiation of the stem cells and introducing therapeutic genes into the cells to balance catabolic effects in OA tissue. The use of multiple genes in chondrocytes or MSCs could better alleviate the signs and symptoms which are characteristic for the disease process. This study lays foundation for future studies where the use of more than one gene of interest would be necessary.

Arthritis ist eine degenerative und entzündliche Krankheit, die durch ein Ungleichgewicht von katabolischen und anabolischen Faktoren verursacht wird. Sie tritt bei Menschen und Hunden gleichermaßen auf. Die wichtigsten katabolischen Mediatoren Interleukin (IL)-1β und Tumor Necrosis Faktor α (TNFα) stimulieren die Expression von weiteren entzündungsfördernden Mediatoren, die beim Abbau von Knorpelgewebeproteinen mitwirken und letztendlich zum Verlust von Knorpel führen. Die Natur der Krankheit Arthritis bedingt, dass für die gleichzeitige Bekämpfung der Entzündung und den Wiederaufbau des Knorpels sowohl entzündungshemmende als auch wachstumsfördernde Gene präsent sein müssen. Derzeit gibt es keine Behandlungsmethode für eine Heilung von Arthritis. Dennoch eröffnet die regenerative Medizin in Kombination mit der Gentherapie eine vielversprechende Behandlungsmöglichkeit in Gestalt einer gezielten Co-Expression zweier Gene zur Bekämpfung der Krankheit. Diese Forschungsarbeit konzentriert sich auf die Effekte der Co-Expression des Wachstumsfaktors Insulin-like Growth Faktor-1 (IGF-1) und dem entzündungshemmenden Zytokin IL-4 auf knorpelabbauende und knorpelregenerierende Faktoren in kaninen in vitro Knorpelzellen- und mesenchymalen Stammzellenmodellen. Analysiert wurden die regenerativen und entzündungshemmenden Effekte von IGF-1 und IGF-1/IL-4 in einem entzündlichen in vitro Knorpelzellenmodell. Die Co-Expression der Transgene wurde mit einem Immuntest überprüft. Die entzündungsfördernden Mediatoren IL-1β, TNFα, Matrix Metalleoproteinase (MMPs), Inducible Nitric Oxide Synthase (iNOS) sowie IGF- Binding Proteine (IGFBPs) wurden mit Hilfe von real-time qRT-PCR analysiert. Die Regeneration von extrazellulären Matrixproteinen wurde auf der mRNA- und Protein-Expressionsebene demonstriert. Unter Anwendung von real-time qRT-PCR, FACS und Immunzytochemie wurden mesenchymale Stammzellen (MSCs) von Hunden isoliert und basierend auf ihren morphologischen und biochemischen Besonderheiten charakterisiert. Die Stammzellen wurden mit IGF-1/IL-4 transfiziert, um das chondrogenetische Potential von IGF-1 im Vergleich zu einem chondrogenetischen Medium, das TGFβ3 enthält, zu testen. Stabile, mit pCOX2-IL-4 transfizierte Zellen wurden mit pVitro2-IGF-1 supertransfiziert. Co-Kulturen, die stabil transfizierte Zellen und Chondrozyten oder MSCs enthalten, wurden dahingehend untersucht, ob sie die Fähigkeit besitzen, das extrazelluläre Matrixprotein Type II Kollagen zu bilden und die Expression des Kollagen abbauenden Mediators zu reduzieren. Die Ergebnisse des pro- inflammatorischen Chondrozytenmodells zeigen, dass in Proben, die mit IGF-1/IL-4 transfiziert worden waren, sowohl entzündungsfördernde Mediatoren als auch IGFBPs herunter-reguliert waren im Vergleich zu Kontollproben, die weder stimuliert noch transfiziert worden waren. Darüber hinaus wiesen die mit IGF-1/IL-4 transfizierten Proben und auch solche, die nur mit IGF-1 transfiziert wurden, Anzeichen für eine Regeneration auf, die sich in der Expression von Aggrecan, Type II-Kollagen und SOX9 ausdrückten. Im Anschluss an die Charakterisierung von cMSCs, konnte gezeigt werde, dass sich diese unter Verwendung eines chondrogenetischen Mediums mit TGFβ3 und des nicht- viralen Vektors, der IGF-1/IL-4 enthält, einer Chondrogenese unterziehen. In beiden Situationen wurde eine Chondrogenese durch die Expression von Knorpelmarkern, namentlich Aggrecan und Type II Kollagen, nachgewiesen. In der zweiten Woche der Kultivierung mit TGFβ3 wurde der Hypertrophie-Marker Type X-Kollagen nachgewiesen. Co-Kulturen mit stabil transfizierten Zellen zeigten zudem eine Hoch-Regulierung von Type II-Kollagen und eine Herunter-Regulierung von MMP-13 unter pro-inflammatorischen Bedingungen. Insgesamt demonstriert diese Untersuchung die Eignung der kombinierten Expression von IGF-1 und IL 4 zur Stimulation der Synthese von Proteoglykan und Type II-Kollagen und der Herunter-Regulierung der degenerierenden Effekte von IL-1β und TNFα in Chondrozyten- und Co-Kulturmodellen. Die Co-Expression von therapeutischen Genen in MSCs ermöglicht einerseits die Stimulierung der Ausdifferenzierung von Stammzellen und andererseits den Ausgleich der katabolischen Effekte der Arthritis. Durch die Verwendung mehrerer Gene in Chondrozyten oder MSCs könnte eine bessere Linderung der für den Krankheitsverlauf bei Arthritis charakteristischen Symptome erreicht werden. Diese Arbeit legt den Grundstein für zukünftige Forschungsvorhaben, bei denen dann mehr als nur ein Gen von Interesse untersucht werden müsste.