Die Entwicklung bzw. Testung von NDV-AIV Rekombinanten war Gegenstand dieser Arbeit. Mittels reverser Genetik wurde der H9-ORF des LPAIV Stammes A/turkey/Wisconsin/1/66 (H9N2) in die intergene Region zwischen F- und HN-Gen des NDV Clone 30-Genoms inseriert und infektiöses Virus generiert. Die Insertion der zusätzlichen Transkriptionseinheit führte zu einer verzögerten Replikation, wobei aber zum parentalen Virus vergleichbare Endtiter erreicht wurden. Die Fremdgenexpression wurde mittels indirekten Immunfluoreszenz-Tests (IFT), Western Blot-Analyse (WB) und Radioimmunpräzipitationsanalyse (RIP) nachgewiesen. Die Fremdgeninsertion blieb nach 10-maliger Passage im Ei erhalten. Eine Steigerung der Virulenz durch die zusätzliche Expression des H9 Proteins in NDV konnte weder im ICPI noch nach Immunisierung von SPF-Hühnern und Puten festgestellt werden. Eine einmalige Immunisierung mit der H9-exprimierenden NDV-Rekombinante induzierte in SPF-Hühnern Schutz gegen eine letale Infektion mit velogenem NDV und reduzierte die Ausscheidung des Virus gegenüber nicht-immunisierten Kontrolltieren. In Puten induzierte eine einmalige Immunisierung mit NDV-H9 einen partiellen Schutz gegen klinische Erkrankungen, reduzierte die Ausscheidung des Virus gegenüber Kontrolltieren jedoch nicht signifikant. Nach einmaliger Immunisierung mit NDV-H9 konnten weder in SPF-Hühnern, noch in Puten H9-spezifische Antikörper detektiert werden, so dass kein Schutz gegen klinische Erkrankungen nach einer Infektion mit einer maximalen Dosis AIV A/turkey/Wisconsin/1/66 (H9N2) induziert wurde. Das klinische Bild wie auch die Ausscheidung des Virus differierten zwar nach Belastungsinfektion von immunisierten und AIV-navien SPF-Hühnern und Puten, jedoch waren nur wenige Unterschiede auch signifikant. Ferner wurden in dieser Arbeit AIV Hämagglutinin- oder Neuraminidase-exprimierende NDV-Rekombinanten nach einmaliger Immunisierung auf ihre Schutzwirkung gegen HPAIV-Infektionen vom Subtyp H5 untersucht. Die mit einer N1-exprimierenden NDV-Rekombinante immunisierten Tiere zeigten gegenüber den Kontrollen eine verlängerte Überlebenszeit nach Infektion mit HPAIV H5N1, was auf eine Beteiligung des Neuraminidase-Proteins an einer schützenden Immunität hindeutet. NDV- Rekombinanten, die entweder HPAIV H5 (NDV-H5) oder durch Deletion basischer Aminosäuren modifiziertes H5 (NDV-H5LP) exprimieren bzw. H5 und N1 ko- exprimieren, (NDV-H5N1) wurden auf ihre Schutzwirkung gegen Infektion mit dem homologen (AIV A/whooper swan/Germany/R65/06 (H5N1)), oder heterologen AIV-H5 Stämmen (A/duck/Vietnam/TG24-01/05 (H5N1); A/chicken/Italy/8/98 (H5N2)) überprüft. Eine einmalige Immunisierung mit einer der drei Rekombinanten induzierte in SPF-Hühnern Schutz gegen klinische Erkrankungen nach einer letalen Infektion mit homologen HPAIV H5N1 und verhinderte die Ausscheidung des Virus. Nach Infektion mit heterologem HPAIV H5N1 trat bei allen immunisierten Tieren eine gegenüber den naiven Kontrollen deutlich reduzierte klinische Symptomatik und Mortalität auf und die Ausscheidung des Virus bewegte sich im Durchschnitt auf einem niedrigen Niveau. Nach Infektion mit heterologem HPAIV H5N2 blieben alle immunisierten Tiere gesund und wiesen im Gruppendurchschnitt eine deutlich reduzierte Ausscheidung des Virus nahe des Detektionslimits auf, während die Kontrolltiere eine hohe Virusgenomlast ausschieden und 90 % verstarben. Die Rekombinanten NDV-H5, NDV-H5LP, sowie NDV-H5N1 zeigten damit eine gute Schutzwirkung sowohl gegen homologe, als auch gegen heterologe Belastungsinfektion mit HPAIV H5. Dabei unterschieden sich die drei Rekombinanten in ihrer Schutzwirkung nicht. Darüber hinaus konnten Tiere, die mit H5- bzw. N1-exprimierenden NDV-Rekombinanten immunisiert worden waren, durch die An- oder Abwesenheit AIV NP-spezifischer Antikörper von infizierten Tieren unterschieden werden.
The purpose of this thesis was the development and testing of NDV-AIV recombinants respectively. Using reverse genetics the H9-ORF of the LPAIV strain A/turkey/Wisconsin/1/66 (H9N2) was inserted into the intergenic region between the F and HN genes of NDV Clone 30 and an infectious virus was generated. Inserting an additional transcription unit led to a delay of replication but the final titers were comparable to the parent virus. Expression of the foreign gene was demonstrated using indirect immunofluorescence (IFT), Western blot analysis (WB) and radioimmunoprecipitation assay (RIP). The insert remained stable after ten passages in eggs. No increase in virulence resulting from the additional expression of the H9 protein in NDV was registered, neither in the ICPI nor post immunisation of turkeys and SPF chickens. A single immunisation of SPF chickens with NDV expressing H9 induced protection against clinical symptoms after a lethal infection with velogenic NDV and reduced the excretion of the virus. A single immunisation with NDV-H9 resulted in partial protection of turkeys against clinical symptoms but virus excretion was not significantly reduced in comparison to naive animals. However, neither in SPF chickens nor in turkeys were H9 specific antibodies detectable after immunisation. Therefore no protection against clinical symptoms after challenge infection with A/turkey/Wisconsin/1/66 (H9N2) was induced. Immunised and AIV-naive SPF chickens and turkeys displayed differences in clinical symptoms and virus excretion, but most differences were not significant. Protective efficacy against the HPAIV H5 infection after a single immunisation with NDV expressing AIV hemagglutinin and neuraminidase was also investigated. Animals immunised with NDV expressing N1 revealed prolonged survival in comparison to the control group after challenge infection with HPAIV H5N1 indicating a contribution of N1 to protective immunity. Furthermore NDV expressing HPAIV H5 (NDV-H5) or HPAIV H5 modified by deletion of the polybasic cleavage site (NDV- H5LP), or coexpressing H5 and N1 were evaluated for their protective efficacy after challenge infection with homologous (A/whooper swan/Germany/R65/06 (H5N1)) or heterologous (A/duck/Vietnam/TG24-01/05 (H5N1); A/chicken/Italy/8/98 (H5N2)) HPAI viruses. A single immunisation of SPF chickens with either one of these recombinants induced protection against clinical signs after homologous HPAIV challenge infection and inhibited virus excretion. After challenge infection with heterologous HPAIV H5N1 all immunised animals displayed few clinical symptoms, low mortality, and a low level of virus excretion. After challenge infection with heterologous HPAIV H5N2 all immunised animals remained healthy and the low level of virus excretion was close to the detection limit, whereas naive animals excreted high levels of viral RNA and 90 % died. The recombinants (NDV-H5, NDV-H5LP, and NDV-H5N1) thus demonstrated a high level of protection against homologous and heterologous HPAIV H5 challenges without any differences between one another. Additionally chickens immunised with NDV expressing H5 or N1 could be distinguished from infected animals by the absence of AIV NP specific antibodies.
