Isolierung und Identifizierung des Adenosin-Tetraphosphats aus dem endothelialen Sekretom

Abstract

Kardiovaskuläre Erkrankungen und ihr Hauptrisikofaktor Bluthochdruck sind die häufigste Todesursache in den westlichen Industrieländern. Die Mehrzahl der Hypertonie-Erkrankungen werden der essentiellen Hypertonie zugeordnet, deren Ätiologie und Pathogenese nicht ausreichend erforscht ist. Pathognomonisch für die essentielle Hypertonie ist der erhöhte periphere Gefäßtonus. Endothelzellen, die durch verschiedene Stimuli zur Sekretion vasoregulatorischer Mediatoren angeregt werden, sind an der vaskulären Tonusregulierung beteiligt. Dysfunktionales Endothel scheint das Verhältnis zwischen vasokonstriktiven und vasodilatativen Mediatoren nicht mehr auszubalancieren zu können. Die physiologischen und pathophysiologischen endothel-abhängigen tonusregulierenden Mediatoren sind jedoch zum gegenwärtigen Zeitpunkt nur teilweise erfasst. Zu den bekannten vasoregulatorischen Substanzen gehören NO, Prostazyklin und Endothelin, aber auch extrazelluläre Nukleotide. Nukleotide sind die dem purinergen Rezeptorsystem zugrunde liegenden Agonisten, die an glatten Muskelzellen zur Kontraktion führen und an Endothelzellen die Synthese vasodilatativer Substanzen anregen. Bisher ist bekannt, dass Endothelzellen neben dem Mononukleotid ATP auch das stark vasokonstriktorisch wirksame Dinukleotid Uridin-Adenosin-Tetraphosphat synthetisieren und sezernieren. In der vorliegenden Studie wurde geprüft, welche bisher nicht identifizierten Mononukleotide im endothelialen Sekretom enthalten sind. Dazu wurde das Sekretom stimulierter humaner mikrovaskulärer Endothelzellen aufgereinigt. Im ersten chromatographischen Schritt wurden die Nukleotide durch eine präparative Reversed-Phase-Chromatographie isoliert. Mittels eines Affinität- Chromatographie-Schritts erfolgte die Trennung der Mono- von den Dinukleotiden. Im letzten Schritt wurden die Substanzen durch den Einsatz einer Reversed-Phase-Chromatographie entsalzt. Mittels Massenspektrometrie wurde eine Substanz mit der molekularen Masse 588,4 Dalton nachgewiesen. Durch MALDI-TOF/TOF-Massenspektrometrie konnte diese Masse dem Mononukleotid Adenosin-Tetraphosphat zugeordnet werden. Des weiteren wurde Adenosin- Tetraphosphat an der isolierten perfundierten Niere auf seine vasoaktive Wirkung hin überprüft. Adenosin-Tetraphosphat wurde als stark vasokonstriktorisch wirksam charakterisiert. Als entsprechender Rezeptor wurde der Rezeptor P2X1 identifiziert. In der vorliegenden Arbeit wurde das stark vasokonstriktiv wirksame Adenosin-Tetraphosphat im Überstand kultivierter stimulierter Endothelzellen nachgewiesen. Dieses Ergebnis stützt die Hypothese, dass Adenosin-Tetraphosphat an der Regulierung des vaskulären Tonus beteiligt ist. Die funktionelle Relevanz dieses Mediators, seine Bedeutung für die Pathogenese von Herz-Kreislauf-Erkrankungen und die Suche nach selektiven Antagonisten müssen Gegenstand weiterer Studien sein.

Cardiovascular diseases are the most common cause of death in industrialised countries. In the majory of cases the main risk factor is primary hypertension. Etiology and pathogenesis of primary hypertension still remain unanswered up to now. An enormous number of studies in the past have been devoted to investigating the role of the endothelium in primary hypertension. A large body of evidence indicates that essential hypertension is characterized by endothelial dysfunction characterized by disordered balance between vasodilatative and vasoconstrictive substances. A spectrum of vasoactive substances synthesised in the endothelium is known; of these, nitric oxide, prostacyclin and endothelin are the most important ones. Also extracelulluar nucleotids play a major role for the regulation of vascular tonus. For example, adenosine triphosphate and uridine adenosine tetraphosphate are known endothelial vasoactive nucleotides. In this study another vasoactive nucleotid was isolated of the supernatant from human microvascular endothelial cells. The supernatant from mechanically stimulated human microvascular endothelial cells was purified using chromatographic methods. In the first step nucleotids were isolated by preparative reversed- phase-chromatography. Secondly, mononucleotids and dinucleotids were seperated by an affinity chromatography. The last step attended desalinisation and preparation for mass spectrometry. A substance of 588,4 Da was detected with mass spectrometry. This mass was identified as the mononucleotid adenosine tetraphosphate by MALDI-TOF-TOF-mass spectrometry. In addition, adenosine tetraphosphates vasoactivity was reviewed in the perfused rat kidney. Adenosine tetraphosphate acts as a potent vasoconstrictor in the kidney. The P2X1-receptor was identified as corresponding receptor In this study, adenosine tetraphosphate was isolated from the supernatant from mechanically stimulated human microvascular endothelial cells. Its release suggest that this compound functions as an important vasoregulator. Further studies should investigated its relevance in detail.