In situ detection, molecular epidemiology, and improvement of molecular tools for the understanding and diagnosis of infections caused by spirochetes

Abstract

Pathogenic spirochetes are the causative agents of some re-emerging diseases with global significance such as human intestinal spirochetosis (HIS), syphilis, Lyme disease and leptospirosis. Limitations in isolation and cultivation of these microorganisms lead to under- and misdiagnosis of bacterial infections. Fluorescence in situ hybridization (FISH), a technique designed to simultaneously visualize and identify microorganisms in biopsy samples, is an accurate microscopy tool for the diagnosis and understanding of pathogenicity in several infections. FISH, in combination with other molecular methods, was applied for the diagnosis of HIS and the identification of Treponema pallidum, the causative agent of syphilis. Brachyspira spp., the infectious agent of HIS, is a slow growing and fastidious anaerobe spirochete that colonizes the human colonic mucosa. Current routine clinical diagnosis of HIS involve histopathology analysis without molecular identification of the causative agent. Genus-specific FISH, in combination with 16S rRNA gene PCR and sequencing were applied to 149 intestinal biopsies from 91 patients, previously diagnosed with HIS by histopathology. The genus Brachyspira was identified in 77 patients, 53 of which cases could be assigned to the B. aalborgi lineage, 23 to B. pilosicoli, one mixed infection and 14 FISH and PCR negative cases. Four out of the 14 negative cases showed colonization of the intestinal epithelium by rods and cocci only, suggesting a misdiagnosis by histopathology. Syphilis is a multi-systemic disease characterized by its atypical clinical manifestations and complex diagnosis. Its causative agent, Treponema pallidum, disseminates through the body via the circulatory system and has not yet been successfully cultured in vitro. Although serology is currently used for the identification of different stages of infection, the results may be difficult to interpret due to an overlap of the signs and symptoms. A species-specific FISH probe assay, designed to target the 16S rRNA gene, was used to show the presence of T. pallidum in four different tissue samples: lymph node tissue of an HIV patient, preputial tissue, oral mucosa, and tonsils. Additionally, recombinant strains of Borrelia burgdorferi, the causative agent of Lyme disease, were used to understand the binding role of candidate adhesion protein Tp0751 (pallilysin) from T. pallidum as a factor promoting bacterial dissemination in animal models. Four different strains of B. burgdorferi, were used to assess the function of Tp0751 in in vitro and in vivo experiments. With the use of video tracking microscopy, the binding interaction of spirochetes was quantified in different conditions and showed that Tp0751 is an adhesin capable of restoring bacteria-vascular interaction that may play a role in bacterial dissemination. This dissertation explores the benefits of microscopy techniques for the understanding of infections caused by spirochetes. FISH facilitates the accurate diagnosis of HIS and provides insights about the invasiveness and spatial distribution of T. pallidum in syphilis. Lastly, intravital and video tracking microscopy helps in the identification of molecules linked to virulence factors related to motility and bacterial dissemination in syphilis and Lyme disease.

Pathogene Spirochäten sind Erreger von weltweit, auftretenden Infektionskrankheiten wie der humanen intestinalen Spirochätose (HIS), Syphilis, Lyme-Borreliose und Leptospirose. Dabei führen die einschränkten Isolierungs- und Kultivierungsmöglichkeiten dieser anspruchsvollen Mikroorganismen zu Unter- und Fehldiagnosen der Infektionen. Fluoreszenz-in- situ-Hybridisierung (FISH), eine Technik zur gleichzeitigen Visualisierung und Identifizierung von Mikroorganismen in Biopsieproben, ist ein akkurates Instrument für die Diagnose und das Verständnis der Pathogenität verschiedener Infektionen. In Kombination mit anderen molekularen Methoden, wurde FISH zur Diagnose der HIS und die Identifizierung von Treponema pallidum subsp. pallidum - dem Erreger der Syphilis - in klinischen Fällen eingesetzt. Brachyspira spp., der Infektionserreger von HIS, ist eine langsam wachsende und anspruchsvolle anaerobe Spirochete, die die menschliche Kolonmukosa kolonisiert. Die aktuelle Routine zur klinischen Diagnose von HIS beinhalten die Histopathologie-Analyse ohne molekulare Identifizierung der Erreger. Die Genus-spezifische FISH wurde in Kombination mit 16S rRNA-Gen PCR und Sequenzierung auf 149 Darmbiopsien von 91 Patienten angewendet, welche zuvor mit HIS durch Histopathologie diagnostiziert worden waren. Die Bakteriengattung Brachyspira wurde bei 77 Patienten identifiziert. Von diesen konnten 53 den B. aalborgi, 23 B. pilosicoli, einer gemischten Infektion und 14 FISH- und PCR-negativen Fällen zugeordnet werden. Vier der 14 negativen Fälle zeigten eine Kolonisation des Darmepithels nur durch Stäbchen- und Kokken, was auf eine Fehldiagnose durch Histopathologie hindeutet. Syphilis ist eine humane Multisystem-Erkrankung mit atypischen klinischen Manifestationen und komplexer Diagnose. Der Erreger der Syphilis ist das Bakterium Treponema pallidum und ist noch nicht erfolgreich in vitro kultiviert worden. Der Erreger verbreitet sich durch den menschlichen Körper über das Kreislaufsystem. Obwohl die Serologie derzeit zur Identifizierung verschiedener Stadien der Infektion verwendet wird, können die Ergebnisse aufgrund einer Überschneidung der Zeichen und Symptome schwer zu interpretieren sein. Ein spezies-spezifischer zur 16S-rRNA-Gen-Markierung entworfener FISH-Experiment-Sonden wurde verwendet, um die Anwesenheit von T. pallidum in vier verschiedenen Gewerbebiopsien zu zeigen: ein Leisten- Lymphknotengewebe eines HIV-Patienten, ein präputiales Gewebe eines Patienten nach Phimose OP, eine Mundschleimhautbiopsie und eine Gewebebiopsie aus Tonsillen. Zusätzlich wurden rekombinante Borrelia burgdorferi Bakterienstämme, die Erreger der Lyme-Borreliose, verwendet, um die Bindungsrolle des Kandidaten-Adhäsionsproteins Tp0751 (Pallilysin) aus T.pallidum als fördernder Faktor zur bakteriellen Verbreitung in Tiermodellen zu verstehen. Vier verschiedene Bakterienstämme von B. burgdorferi wurden verwendet, um die Funktion von Tp0751 in in vitro und in vivo Experimenten zu beurteilen. Mit der Verwendung des Mikroskopischen Videotracking-System wurde die Bindungsinteraktion von Spirochäten unter verschiedenen Bedingungen quantifiziert. Die Ergebnisse zeigten, dass Tp0751 ein Adhäsin ist, das die bakterien-vaskuläre Wechselwirkungen wiederherstellen und eine Rolle bei der Bakterienverbreitung spielen könnte. Diese Dissertation untersucht die Vorteile mikroskopischer Techniken bei der Untersuchung von Spirochäten- Infektionen. FISH zeigt die Invasivität und räumliche Verteilung von T. pallidum in Syphilis und unterstützt bei der Diagnose von HIS. Intravitale Mikroskopie hilft zudem bei der Identifikation von Molekülen und Virulenz Faktoren, die eine Rolle bei der Verbreitung der Bakterien in Syphilis- und Lyme-Borreliose spielen.