Structural and Functional Analysis of Lin28-Mediated Inhibition of let-7 miRNA Biogenesis

Abstract

Lin28 is an essential RNA-binding protein that is ubiquitously expressed in embryonic stem cells. Its physiological function has been linked to regulation of differentiation, development, oncogenesis as well as glucose metabolism. Recently, emerging evidence has revealed that Lin28 mediates these pleiotropic functions by inhibiting let-7 miRNA biogenesis and by modulating the translation of target mRNAs. In this PhD thesis, the structural and mechanistic basis of Lin28-mediated inhibition of let-7 biogenesis was analyzed. Lin28 binds to the terminal loop (pre-element) of precursor (pre) let-7 miRNA thereby impairing a cleavage by the ribonuclease III Dicer. Both Lin28 RNA-binding domains (RBDs), a cold-shock domain (CSD) and a retroviral- type Zn-knuckle domain (ZKD), were essential for pre-let-7 binding and Dicer inhibition. A systematic binding analysis demonstrated that both domains bind to single-stranded (ss) nucleic acids with the ZKD mediating specific binding to a conserved GGAG motif, while the CSD showed an overall low sequence specificity with a slight preference for pyrimidine-rich oligonucleotides. Crystal structures of Lin28 CSDs in complex with hexa- and heptathymidine as well as hexauridine revealed the molecular basis for the limited sequence specificity, as binding of ssDNA/RNA was dominated by unspecific base-stacking interactions. Further electrophoretic mobility shift assays with pre-let-7 and Lin28 variants confirmed the importance of the GGAG motif, as mutations within this motif or the ZKD impaired both binding and inhibition of Dicer mediated pre-let-7 processing. However, only the isolated CSD, but not the ZKD, could bind to pre-let-7 alone. Using site-directed mutagenesis in combination with a time-resolved RNA remodeling assay, I could show that Lin28 binds in a stepwise manner to pre-let-7. After initial binding of the CSD, a structural change within pre-let-7 is induced leading to melting of Dicer cleavage site and facilitating subsequent binding of the ZKD to the conserved GGAG motif. Thereby Lin28 can recognize all let-7 members despite their structural diversity and ensure specific inhibition of their biogenesis. Apart from competitive inhibition, Lin28 is also known to promote polyuridylation of pre- let-7 thereby labeling it for degradation. Using co-immunoprecipitation and in vitro uridylation assays, I identified two retroviral-type CCHC Zn-knuckles in TUT4 that are essential for pre-let-7 uridylation in a Lin28-dependent manner. On the Lin28 level, both the C-terminus as well as the two RBDs were indispensable for promoting pre-let-7 uridylation.

Lin28 ist ein essentielles RNA-Bindeprotein, welches ubiquitär in embryonalen Stammzellen exprimiert wird und mit dessen Hilfe induziert pluripotente Stammzellen (iPSC) erzeugt werden können. Seine physiologische Funktion besteht in der Regulation vieler zellulärer Prozesse wie Zelldifferenzierung, Wachstum und Entwicklung als auch Onkogenese. Auf molekularer Ebene inhibiert Lin28 die let-7 miRNA Biogenese und moduliert darüber hinaus die Translation diverser mRNAs. Das Ziel dieser Arbeit lag in der strukturellen und funktionellen Untersuchung der Lin28•pre-let-7 Interaktion, um auf molekularer Ebene zu verstehen, wie Lin28 die let-7 Biogenese inhibiert. Es konnte gezeigt werden, dass Lin28 pre-let-7 spezifisch über dessen terminale Schleife bindet und auf diese Weise eine Prozessierung durch die Ribonuklease Dicer verhindert. Diese Prozesse erforderten die Anwesenheit der beiden Lin28 RNA- Bindedomänen (RBDs), einer Kälteschockdomäne (CSD) und einer retroviralen Zinkfingerdomäne (ZKD). Eine systematische Analyse der Bindungsspezifitäten dieser offenbarte, dass beide Domänen einzelsträngige (ss) DNA und RNA binden, wobei die ZKD eine hohe Spezifität gegenüber einem konservierten GGAG-Motiv aufwies. Im Gegensatz dazu zeigte die isolierte CSD eine sehr breite Spezifität mit einer leichten Präferenz für Pyrimidin-reiche Sequenzen. Kristallstrukturen von Lin28 CSDs im Komplex mit ssDNA/RNA Oligonukleotiden enthüllten, dass deren Bindung im Wesentlichen durch unspezifische Basen- Stapelung erfolgt während kaum Basen-spezifische Wasserstoffbrückenbindungen ausgebildet werden. Elektrophoretische Bindungsstudien von Lin28 Varianten mit pre-let-7 bestätigten die Bedeutung des GGAG-Motivs für die Bindung an pre- let-7. Mutationen innerhalb des GGAG-Motivs als auch der Lin28 ZKD beeinträchtigten sowohl die Bindung als auch die Blockierung der pre-let-7 Prozessierung durch Dicer. Interessanterweise konnte jedoch nur die isolierte CSD, nicht aber die ZKD, an pre-let-7 binden. Weitere Mutagenesestudien zusammen mit einem RNA-Remodellierungstest zeigten, dass Lin28 in einem mehrstufigen Prozess an pre-let-7 bindet. Demnach wird nach einer anfänglichen Bindung der CSD eine strukturelle Änderung in pre-let-7 induziert, die zu einem Aufschmelzen der Dicer-Schnittstelle führt. Dadurch wird eine Bindung der ZKD an das konservierte GGAG-Motiv erleichtert. Auf diese Weise kann Lin28 alle let-7 Familienmitglieder trotz deren strukturellen Diversität erkennen und deren Biogenese spezifisch inhibieren. Neben der kompetitiven Inhibierung ist Lin28 auch dazu in der Lage die Poly-Uridylierung von let-7 zu stimulieren, wodurch diese für den Abbau markiert wird. Durch Co- Immunopräzipitation und in vitro Uridylierungstests konnten zwei essentielle CCHC Zn-Finger in TUT4 identifiziert werden, die essentiell für die Lin28-abhängige pre-let-7 Uridylierung sind. Auf Lin28 Ebene waren sowohl der C-Terminus als auch die beiden RBDs für die pre-let-7 Uridylierung erforderlich.