Charakterisierung bakterieller Translokation am Kolonepithelmodell - Induktion von focal leaks durch E.coli-a-Hämolysin

Abstract

Bakterielle Translokation (BT) der Übertritt intestinaler Keime in extraintestinale Kompartimente ist klinisch bedeutsam beim systemic inflammatory response syndrome, der Sepsis mit konsekutivem multiplem Organversagen sowie bei der Pankreatitis und wird im Zusammenhang mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED) diskutiert. Mit diesen klinischen Bildern geht eine Zunahme der parazellulären Ionenleitfähigkeit und der Permeabilität für Makromoleküle unterschiedlicher Größe einher. Veränderungen der intestinalen Barriereeigenschaften sind potentiell relevant hinsichtlich eines Übertritts luminaler Keime. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Translokationseigenschaften von Escherichia coli-Stämmen im intestinalen Epithel. Es wurden Durchtritte fluoreszenzoptisch (CLSM) und funktionell (Quantifizierung der Translokation, Elektrophysiologie) beschrieben sowie der verursachende Virulenzfaktor identifiziert. BT wurde bisher kaum in Zellkulturmodellen untersucht, obwohl sich die zugrundeliegenden Mechanismen dort besonders gut charakterisieren lassen. Es wurden die Nierenepithelzelllinie MDCK sowie die humanen Kolonkarzinomzelllinien T84, Caco-2 und HT-29/B6 eingesetzt. Letztere eignet sich aufgrund ihrer Zytokinresponsivität als Barrieremodell für CED. Bei CED kommt es zu einer überschießenden Immunantwort auf Bestandteile der eigenen bakteriellen Flora und somit zu einem chronisch rezidivierenden Krankheitsverlauf. Jüngste Forschungsergebnisse lassen neben einer veränderten Immunantwort eine primäre Störung der epithelialen Barrierefunktion durch residente Bakterien der Darmflora vermuten. In dieser Arbeit wurde zunächst die Translokation von Vertretern der E. coli Spezies (E. coli O6:K5, E. coli K1 und E. coli Nissle 1917) an HT-29/B6-Zellen untersucht und dabei entdeckt, dass diese intestinal apathogenen E. coli-Stämme nicht translozieren, auch nicht nach einer durch die Zytokine IL-13 oder TNFa induzierten Barrierestörung. Im Gegensatz hierzu translozierte der ebenfalls untersuchte Stamm E. coli O4 und verursachte gleichzeitig eine dramatische Barrierestörung. Hierbei entsteht ein lokaler Zusammenbruch der epithelialen Barriere, der hier als focal leak erstmals beschrieben wird. Dieser Effekt wird durch das Toxin a-Hämolysin vermittelt. Der Effekt der Läsionsbildung wurde im nativen Kolonepithel der Ratte untersucht und focal leaks auch hier elektrophysiologisch und fluoreszenzoptisch nachgewiesen. Aufgrund der Dimension der focal leaks ist zu erwarten, dass sie den Durchtritt weiterer luminaler Antigene zulassen und dadurch eine krankhafte Immunantwort auslösen können. Es konnte gezeigt werden, dass unter inflammatorischen Bedingungen die Ausbildung dieser Schädigung begünstigt wird und daher einen Circulus vitiosus verursachen kann. Somit beschreibt diese Arbeit einen neuen Pathomechanismus eines bekannten bakteriellen Toxins, E. coli a-Hämolsyin. Über diesen Mechanismus kann eine massive Barrierestörung durch Vertreter der normalen Darmflora des Menschen entstehen.

Bacterial translocation (BT) - the passage of intestinal microorganisms into sterile body compartments - is of clinical relevance in systemic inflammatory response syndrome, sepsis with consecutive multiple organ failure, or pancreatitis, and is believed to be important in chronic inflammatory bowel diseases (IBD). Under these clinical conditions the intestinal barrier is affected: paracellular ion conductivity as well as permeability for macromolecules is increased. Such changes in intestinal barrier function are potentially relevant for translocation of luminal bacteria. Thus, the present work aimed to investigate translocation characteristics of E.coli strains using model intestinal epithelia. Translocation was investigated employing immunofluorescence (CLSM) and functional approaches (quantification of translocation, electrophysiology). In addition, the responsible virulence factor was identified. In the past, BT was rarely studied using adequate cell culture models although they facilitate the study of underlying mechanisms. Therefore, the various cell culture models were tested: MDCK (kidney epithelium) and the colon carcinoma cell lines T84, Caco-2 and HT-29/B6, the latter being cytokine-responsive and therefore constitutes a suitable model to study barrier effects in IBD. In IBD, the immune system overreacts to intestinal bacterial constituents, leading to the chronic relapsing pathologies observed in patients. Apart from an altered immune response, recent studies point towards a primary barrier dysfunction caused by the resident flora in the gut. The present work investigates translocation of E.coli strains (E. coli O6:K5, E. coli K1 and E. coli Nissle 1917). None of these intestinally apathogenic strains translocated, not even after inducing a barrier disruption by TNFa and IL-13 pre-incubation of the epithelia. Interestingly, another strain investigated, E.coli O4, induced a dramatic focal barrier disruption, dubbed focal leak. This effect is mediated by E.coli-a-hemolysin and was demonstrated in cell culture and in native epithelia (rat colon) using electrophysiological and immunofluorescence methods. Focal leaks constitute an interesting new mechanism of barrier disruption and are likely to permit access of luminal antigens, thus initiating a pathologic immune response. It could be shown that proinflammatory conditions promote formation of focal leaks, which may result in a visious circle of inflammation. Therefore the present work describes a new pathologic mechanism for a well-known bacterial toxin, E.coli-a-hemolysin, thus describing a mechanism of barrier disruption caused by commensal bacteria in the human gut.