c-di-GMP Signaltransduktion in der Regulation der Expression des Biofilmregulators CsgD in Escherichia coli

Abstract

Die Wahl eines motilen oder sessilen Lebensstils erfolgt in gram-negativen Bakterien wie E. coli in Abhängigkeit des sekundären Botenstoffs c-di-GMP. Synthetisiert wird c-di-GMP durch Diguanylatzyklasen (DGC) und der Abbau erfolgt durch Phosphodiesterasen. (PDE). Erhöhte c-di-GMP Mengen in der Zelle stimuliert die Biofilmbildung, während niedrige Konzentrationen die Motilität fördern. Biolfime von E. coli benötigen u.a. die Synthese adhäsiver Curli- Fimbrien (bzw. Fasern) wie auch Cellulose. Die Synthese der Curli-Fimbrien sowie der Cellulose-Matrix ist unter der Kontrolle des zentralen Biofilmregulators CsgD. Die Expression von CsgD erfolgt SigmaS-abhängig mit Eintritt in die stationäre Wachstumsphase und unterliegt einer komplexen Regulation. Dabei ist die Transkription von csgD abhängig von zwei c-di-GMP- Kontrollmodulen, YegE/YhjH und YdaM/YciR. C-di-GMP, kontrolliert durch YegE (DGC) und YhjH (PDE), wirkt global und beeinflusst neben der csgD- Transkription auch die Motilität. Die aktive DGC YdaM und die aktive PDE YciR regulieren zusammen mit dem MerR-ähnlichen Transkriptionsfaktor MlrA, der am csgD-Promotor bindet, hochspezifisch die csgD-Transkription. Durch diese Arbeit wird deutlich, dass YdaM, YciR und MlrA Protein-Protein-Interaktionen über Multi-Domänenkontakte eingehen und vermutlich lokal in einem Proteinkomplex die csgD-Transkription regulieren. Innerhalb dieses Komplexes wirkt YdaM als direkter Aktivator von MlrA, während YciR als direkter Inhibitor von YdaM und MlrA eine vorzeitige Aktivierung von csgD verhindert. Weiterhin zeigen in vitro und in vivo Analysen, dass YciR als konserviertes EAL-Protein eine neue Kategorie eines c-di-GMP-Effektors darstellt, das durch Wahrnehmung des zellulären c-di-GMP-Spiegels (generiert zunächst durch YegE, später auch durch YdaM) in seinen inhibitorischen Funktionen antagonisiert wird. YciR agiert somit als Verbindungsglied zweier seriell geschalteten c-di- GMP-Module (YegE/YhjH und YdaM/YciR). Dazu wird deutlich, dass die PDE- Aktivität von YciR zum Abbau von zellulärem c-di-GMP eine Schalterfunktion für die Aktivierung der csgD-Transkription darstellt. Dadurch nimmt YciR die Rolle eines "Trigger"-Enzyms ein, das in Abhängigkeit seines Substrats die Genexpression reguliert. Insgesamt zeigt diese Arbeit somit einen neuartigen Mechanismus innerhalb der c-di-GMP Signaltransduktion auf, bei dem das globale c-di-GMP-Signal, lokal verarbeitet und zu einer spezifischen, fein-regulierten Genexpression führt. Dabei wird zum ersten Mal das Prinzip des "Trigger"-Enzyms in Verbindung mit der c-di-GMP Signalverarbeitung gebracht und es ist anzunehmen, dass dieser Mechanismus eine wichtige Rolle bei lokalen Funktionsweisen von Signalmolekülen spielt.

In gram-negative bacteria like E. coli the transition from a motile to a sessile 'lifestyle' is controlled by the second messenger c-di-GMP which is synthesized by diguanylate cyclases (DGC) and degraded by phosphodiesterases (PDE). In general, elevated levels of c-di-GMP in the cell favor bacterial biofilm formation whereas low concentrations stimulate motility. In E. coli biofilms, curli fimbriae and cellulose represent key adhesive and structural elements. The synthesis of curli fibers and cellulose matrix is under the control of the central biofilm regulator CsgD. The expression of CsgD is sigmaS-dependent and arises with entry into stationary growth phase underlying a complex regulation mechanism. Thereby, two c-di-GMP control modules, YegE/YhjH and YdaM/YciR, regulate csgD transcription. C-di-GMP controlled by YegE(DGC) and YhjH (PDE) acts globally in the cell and affects motility in addition to csgD. In cooperation with the MerR-like transcription factor MlrA, which binds to the csgD promoter, the active DGC YdaM and the PDE YciR regulate csgD transcription in a highly specific manner. This work provides evidence, that the proteins of YdaM, YciR and MlrA interact with each other via multiple domain contacts and probably regulate transcription of csgD as a local protein complex. Within this complex YdaM acts as a direct activator of MlrA, whereas YciR inhibits YdaM and MlrA to prevent an early curli induction. Additionally, in vitro and in vivo analysis show that the conservative EAL domain protein YciR represents a new category of a c-di-GMP effector, which is antagonized in its inhibitory role by sensing the cellular c-di-GMP level (generated first by YegE and later in by YdaM). Thus, YciR acts as a connector or mediator of two serial arranged c-di-GMP modules (YegE/YhjH and YdaM/YciR). By degrading the cellular c-di-GMP the PDE activity of YciR presents the turning point for activation of csgD transcription. Consequently, YciR takes on a role as a 'trigger' enzyme, which regulates gene expression in dependance on its substrate. Altogether, this work shows for the first time a mechanism of c-di-GMP signal transduction, where a global c-di-GMP signal is locally integrated and processed resulting in a specific and hypersensitive gene expression. With this study the principle of a trigger enzyme has been introduced into the c-di-GMP signalling field which has probably great importance in local second messengers functions.