Die Rolle des Low-Density-Lipoprotein-Rezeptorsystems bei der Lykopin-Aufnahme in Endothelzellen

Abstract

Hintergrund: Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind weltweit in der Todesursachenstatistik führend. Hauptursächlich an der Entstehung und Progression der Arteriosklerose beteiligt sind oxidativ modifizierte Lipoproteine. Karotinoide, insbesondere Lykopin, besitzen einen protektiven Effekt auf den Lipoprotein-Modifizierungsgrad. Ihre Verteilung in unterschiedlichen Geweben des humanen und tierischen Organismus, enterale Resorption, Transport- und Ausscheidungswege sind bekannt. Die Resorption auf zellulärer Ebene ist bisher größtenteils ungeklärt. Endothelzellen bilden die Schnittstelle zwischen LDL-gebundenem Transport von Lykopin im Blut, der zellulären Resorption sowie intrazellulärer Wirkungsentfaltung. Sie sind darüber hinaus in der Krankheitsentstehung und Progression der Arteriosklerose und damit verbundener Pathologien involviert. Hypothese: Bisher ist kein Zelloberflächenrezeptor, der an der Internalisierung von Karotinoiden in Endothelzellen beteiligt ist, beschrieben worden. Die Verteilung des Lykopins auf unterschiedliche Lipoproteinklassen im Blut deutet auf eine zelluläre Aufnahme mittels Low-Density-Lipoprotein-Rezeptor (LDLR) und Low-Density Lipoprotein (LDL) hin. Methode: Primäre humane Aorten-Endothelzellen (HAEC) wurden bis zur Konfluenz von 80 % kultiviert. Die LDLR-mRNA-Expression wurde anschließend durch siRNA-Transfektion selektiv reduziert. Nach 24 Stunden Ruhephase wurden die Zellen mit einer 1 bzw. 5 μM Lykopin-Konzentration für 48 Stunden behandelt. Die Lykopinkonzentration je 106 Zellen wurde per HPLC ermittelt. Die LDLR-mRNA-Expression und LDLR-Proteinmenge wurden durch Real- time RT-PCR und Western Blot bestimmt. Ergebnisse: Die LDLR-mRNA-Expression war 72 Stunden nach siRNA-Transfektion in der 1 bzw. 5 μM Lykopin-Gruppe auf 69 ± 31 % bzw. 24 % reduziert. Die prozentuale Lykopinmenge je 106 HAEC in der 1 bzw. 5 μM Lykopin-Gruppe sank auf 55,64 ± 27,76 % bzw. 59,74 ± 6,10 %. Die absolute Lykopinmenge sank von 0,006 ± 0,003 auf 0,004 ± 0,003 bzw. von 0,025 ± 0,01 auf 0,015 ± 0,007 nM/106 Zellen. (Alle Angaben MW ± SD, n = 3). Eine Reduktion des LDLR im Western Blot ließ sich zu diesem Zeitpunkt ebenfalls nachweisen. Diskussion: Die Lykopin-Aufnahme durch HAEC in-vitro scheint überwiegend über das LDL-Rezeptor- Liganden-System zu erfolgen. Wahrscheinlich erfolgt die in-vivo Versorgung humaner Endothelzellen mit Lykopin analog unseres Zellkulturmodells. Die protektive Wirkung von Lykopin ist an ein funktionierendes Rezeptor-Liganden-System für die LDL-Clearance gekoppelt. So kann möglicherweise die akzelerierte Arteriosklerose bei familiärer Hypercholesterolämie mit einer zellulären antioxidativen Minderversorgung mit Lykopin verbunden sein. Die relative Lykopinreduktion 72 Stunden nach siRNA- Transfektion ist größer als die zu diesem Zeitpunkt erreichte Reduktion der LDLR-mRNA-Expression und stellt wahrscheinlich das Resultat unterschiedlicher Expressionsreduktionen im Behandlungszeitraum dar. Die Versuchsergebnisse weisen eine hohe Schwankung auf. Zukünftige Versuche sollten mit einer höheren Lykopin-Endkonzentration und einer höheren n-Zahl durchgeführt werden.

Background: Cardiovascular diseases are the main global cause of death. Arteriosclerosis is mainly promoted by oxidatively modificated lipoproteins. Carotenoids, especially lycopene, have a protective effect on lipoprotein modification. Human and animal carotenoid tissue distribution, enteric resorption, transport and metabolisation are known. Yet cellular resorption is mostly unclear. Involved in development and progression of atherosclerosis and associated pathologies, endothelial cells represent the gateway between LDL bound blood transport of lycopene and cellular resorption with consecutive intracellular action. Hypothesis: No cell surface receptor for the internalisation of carotenoids into endothelial cells has been described. Distribution of lycopene between different lipoprotein classes indicates cellular resorption via low density lipoprotein receptor (LDLR) and low density lipoprotein (LDL) pathway. Methods: Primary human aortic endothelial cells (HAEC) were grown to 80 % confluency. LDLR mRNA expression was selectively reduced by a single siRNA transfection. After a 24 hour rest, cells were treated for 48 hours with either 1 or 5 μM lycopene. The concentration of lycopene in 106 HAEC was determined by HPLC. LDLR mRNA expression and protein levels were investigated by real-time RT-PCR and western blot. Results: LDLR mRNA expression 72 hours after siRNA transfection was reduced to 69 ± 31 % and 24 % in the 1 and 5 μM lycopene group, respectively. Relative cellular lycopene levels in 106 HAEC in the 1 and 5 μM lycopene group were reduced to 55,64 ± 27,76 % and 59,74 ± 6,10 %, respectively. Absolute lycopene levels were reduced from 0,006 ± 0,003 to 0,004 ± 0,003 and from 0,025 ± 0,01 to 0,015 ± 0,007 nM/106 cells, respectively (all data are mean ± SD, n = 3) LDLR protein expression was reduced in western blot as well. Discussion: In-vitro lycopene supply in HAEC is likely mediated by the LDLR/LDL system. Analogous to our cell culture model in-vivo lycopene supply of human endothelial cells is likely mediated by the LDLR/LDL system. Protective effects of lycopene are closely tied to a functional receptor ligand system for LDL clearance. Accelerated atherosclerosis seen in familiar hypercholesterolemia may partially be caused by cellular deficiency of the antioxidant lycopene. Relative lycopene reduction 72 hours after siRNA transfection was higher than corresponding LDLR mRNA expression levels. This may result from temporally variable reduction levels in mRNA expression during the course of the experiment. The results show a rather high variation. Future experiments should be done with a higher lycopene concentration and a higher number of experiments.