Charakterisierung der Expression, Regulation und Funktion des nukleären Hormon Rezeptors Peroxisom Proliferator Aktivator Rezeptor delta in humanen T Lymphozyten

Abstract

Peroxisome proliferator-activated receptor delta (PPARδ) ist ein nukleärer Rezeptor, der der Superfamilie der Steroidhormon-Rezeptoren angehört. Seine biologischen Funktionen sind vielfältig und reichen von der β-Oxidation von Fettsäuren über die Proliferation der Keratinozyten bis hin zur Differenzierung von epithelial Zellen. Die Rolle von PPARδ innerhalb des Immunsystems wurde bislang nicht genau aufgeklärt. Eine Vielzahl von Indizien weisen auf eine zentrale Rolle von PPARδ bei Psoriasis hin. Psoriasis (Schuppenflechte) ist eine häufig auftretende chronisch verlaufende entzündliche Erkrankung der Haut mit einer Prävalenz von 2% - 4% in den westlichen Industrienationen. Da die Psoriasis durch übermäßige Keratinozytenproliferation und Differenzierung gekennzeichnet ist, beschränkte sich die Forschung bislang auf die Bedeutung von PPARδ in Keratinozyten. An der Psoriasispathogenese sind jedoch auch aktivierte T-Zellen beteiligt. Daher wurde im Rahmen dieser Arbeit die Expression und die funktionelle Bedeutung von PPARδ in humanen T-Zellen untersucht. Die Expression konnte sowohl in aktivierten humanen T-Zellen, die aus peripheralen Blut isoliert wurden, als auch in T-Zellen der suprabasalen-Schicht psoritatischer Haut gezeigt werden. Weiterhin wurde PPARδ in T-Zellen durch Typ 1 Interferon (IFN) induziert. Funktionell verstärkt PPARδ die Proliferation primärer T-Zellen und schützt diese sowohl vor Typ 1 IFN-induzierter als auch vor Serumentzug-induzierter Apoptose. Die Untersuchungen ergaben, dass diese zellulären Funktionen durch Aktivierung von ERK1/2 vermittelt werden. Die hier gezeigten Resultate weisen auf eine direkte molekulare Verbindung zwischen den Typ 1 IFN-Signalwegen und PPARδ hin und die funktionelle Rolle von PPARδ in humanen T-Zellen wird deutlich aufgezeigt. Dies deutet daraufhin, dass die Typ 1 IFN vermittelte Induktion von PPARδ möglicherweise für das Ausharren der aktivierten T-Zellen in läsionaler Haut bei Psoriasis verantwortlich ist. Für Experimente im Rahmen der Untersuchung der Funktionen von PPARδ in TZellen wurde die Expression des PPARδ-Gens mittels siRNA inhibiert. Die siRNA wurde dabei von einem Lentivektor exprimiert. Aufgrund ihrer Charakteristika stellen die Lentiviren besonders geeignete Vektoren für den Gentransfer dar. Replikationsinkompetente lentivirale Vektoren sind in der Lage ruhende und sich nicht teilende Zellen zu infizieren und ihr genetisches Material (shRNA) in das Zielzellgenom zu integrieren. Dadurch wird die siRNA in den infizierten Zellen und deren Tochterzellen stabil exprimiert. Für experimentelle Anwendungen lentiviraler Vektoren sind ein hoher Titer der Virusüberstände und effiziente Virus- Konzentrationen wichtige Faktoren. Aus diesem Grund war das Ziel zu Beginn dieser Arbeit die Produktion und Aufkonzentrierung von Lentivektoren zu optimieren. Dazu wurden mehrere bereits in der Literatur veröffentlichte Protokolle unter Verwendung verschiedener Transfervektoren, die sich in der Größe unterscheiden (7.5-13.2 kb), evaluiert. In dieser Arbeit konnte ein modifiziertes Virusproduktionsprotokoll, das anwendbare Titer (von bis zu 107 V/ml) für eine Auswahl unterschiedlicher Lentivektoren mit Inserts bis zu 7.5 kb liefert, etabliert werden. Ferner zeigten die Resultate, dass die Ausbeute an Viren nach der Ultrazentrifugation abhängig ist von der Größe des im Vektor beeinhaltenden Inserts und dass die Ausbeute stark abnimmt bei großen Inserts. Auch wurde hier ein schnelles (4h) und leicht anwendbares Zentrifugationsprotokoll präsentiert, welches eine hohe Ausbeute auch für große und fragile Vektoren ermöglicht.

Peroxisome proliferator-activated receptor delta (PPARδ) is a nuclear hormone receptor regulating diverse biological processes, including β-oxidation of fatty acid, proliferation of keratinocytes and epithelial cell differentiation. The role of PPARδ in the immune system has not been thoroughly studied to date. Several lines of evidence support a role for PPARδ in psoriasis pathogenesis. Psoriasis is a chronic inflammatory skin disease with an estimated prevalence of 2% - 4% in the western civilization. Given that psoriasis is characterized by keratinocyte hyperproliferation and aberrant terminal differenctiation of keratinocytes, research has been conducted on the role of PPARδ in keratinocytes. However, a large amount of clinical and experimental evidence supports a main role for T cells in pathogenesis of psoriasis. Therefore, the present work aimed at characterizing the expression and function of PPARδ in human T cells. In the course of this work, the expression of PPARδ was shown in activated human T cells purified from peripheral blood, as well as in T cells isolated from affected psoriasis skin lesions. Furthermore, PPARδ is induced in T cells upon stimulation with type 1 interferon (IFN). Functionally, PPARδ enhances proliferation of primary T cells and blocks apoptosis induced by type 1 IFN and by serum deprivation. It was shown that these cellular functions are mediated by activation of ERK1/2 signaling. The results presented in this work establish a direct molecular link between type 1 IFN signaling and PPARδ, define a functional role for PPARδ in human T cells, and suggest that the induction of PPARδ by type 1 IFN contributes to the persistence of activated T cells in psoriasis skin lesions. To study the function of PPARδ in T cells the suppression of PPARδ gene expression was necessary. This was accomplished using siRNA expressed from a lentiviral vector. Vectors based on lentiviruses are highly efficient vehicles for gene transfer approaches and are widely used in basic research. The use of replication–deficient pseudotyped HIV-derived lentiviral vectors allows the efficient transduction of primary cells including human T cells. Generation of high titer lentiviral stocks and efficient virus concentration are central to maximize the utility of lentiviral technology. Therefore, the present work initlally established protocols for optimizing the production and concentration of lentivectors. Published protocols for lentivirus production on a range of transfer vectors differing in size (7.5–13.2 kb) were evaluated. Based on these, a modified virus production protocol was developed robustly yielding useful titers (up to 107 / ml) for a range of different transfer vectors containing packaging inserts up to 7.5 kb. The results also showed that the recovery of virus after concentration by ultracentrifugation depends on the size of the packaged inserts, heavily decreasing for large packaged inserts. To address this technical limitation, a fast (4h) centrifugation protocol at reduced speed allowing high virus recovery even for large and fragile lentivirus vectors was developed.