Entwicklung und Charakterisierung einer Methode zum direkten ballistischen Transfer von Genen in Tumorzellen zur Herstellung von autologen Anti- Tumorvakzinen

Abstract

Die Schwachstelle aller Gentherapieansätze ist immer noch das Gentransferverfahren. Optimal zur klinischen Anwendung wäre eine Transfektionsmethode, durch die bei geringem Aufwand und ohne Sicherheitsrisiko eine effiziente Transfektion nur der gewünschten Zellen in ausreichender Anzahl erreicht werden könnte. Dabei sollte die Zelle ausschließlich in der erforderlichen Art und Weise verändert werden, ohne daß andere, ihr eigene Merkmale modifiziert werden. Die Methode des ballistomagnetischen Gentransfers stellt einen Ansatz zur Lösung dieses Problems dar (134). Sie ist jedoch dadurch limitiert, daß nur adhärente Zellen effektiv transfiziert werden können. Es muß also vor der Transfektion aus dem vom Patienten exzidierten Tumorgewebe eine adhärente Zellkultur hergestellt werden. Bei den von uns am Centrum Somatische Gentherapie, Berlin durchgeführten Gentherapiestudien stellt dies eine beträchtliche Einschränkung dar, da es bei der Kultivierung der aus Tumormaterial gewonnenen Zellen zu einer Selektion der adhärierenden Zellklone kommt und demzufolge alle nichtadhärenten Tumorzellen verworfen werden. Hierdurch wird der Tumorzellpool, aus dem später die gentherapeutischen Vakzine hergestellt werden, eingeschränkt. Mit zunehmender Kultivierungsdauer nimmt darüberhinaus der Anteil der schnellwachsenden Tumorzellen gegenüber den langsam wachsenden in der Kultur zu. Zum Zeitpunkt der Transfektion repräsentieren die zur Herstellung der Vakzine verwendeten Tumorzellen den Tumor, aus dem sie gewonnen wurden, also nur noch teilweise. Die längerfristige Kultivierung der operativ entnommenen Tumorzellen ist auf etwa 30% der operierten Patienten begrenzt, da nur bei diesem Anteil der Patienten die Zellen erfolgreich in Kultur gehalten werden können. Im Rahmen meiner Arbeit wurde der ballistomagnetische Gentransfer für die Anwendung in klinischen Gentherapiestudien modifiziert. Der Arbeitsablauf wurde optimiert und seine Effektivität gesteigert. Um Zellen unabhängig von ihren Adhärenzeigenschaften transfizieren zu können, werden die Zellen nun auf Petrischaleneinsätze, die mit einer mikroporösen Polycarbonatmembran bespannt sind, kurzzeitig in Form einer Monolayer aufgebracht. Diese Methode wird im folgenden MIP-Methode (Mikroporöse-Polycarbonatmembran-Methode) genannt. Durch Kombination des ballistomagnetischen Gentransfers mit der MIP-Methode ist es jetzt prinzipiell möglich, die autolog gewonnenen Tumorzellen aller Patienten ohne vorherige Kultivierung direkt zu transfizieren. Dies erlaubt die Herstellung von gentherapeutischen Vakzinen aus Tumorzellen mit immunologisch unveränderter Zelloberfläche und damit erhöhter Wahrscheinlichkeit, die für die Immunisierung relevanten Strukturen wie z.B. Tumorantigene, dem Immunsystem des Patienten zu präsentieren. Zellen, die unter Anwendung der MIP-Methode ausgesät wurden, konnten zu 89% im Durchschnitt der verwendeten Zellinien nach ballistischem Gentransfer von der Polycarbonatmembran geerntet werden. Bei Anwendung der Vergleichsmethode nach Burkholder et al. (123) konnten 58% der Zellen zurückgewonnen werden. Auch die magnetische Separation war effizienter, wenn die Zellen vorher mit der MIP-Methode ausgesät wurden. So erhielt man nach dem Gentransfer im Mittel über die verwendeten Zellinien 1.7 mal mehr Zellen und nach magnetischer Separation insgesamt 3.7 mal mehr Zellen als mit der Vergleichsmethode. Die Transfektionsraten, die sich nach durchflußzytometrischer Auswertung für beide Methoden ergaben, unterschieden sich nicht signifikant. Betrachtet man jedoch die absolute Zahl der transfizierten Zellen, so ist die Anwendung der MIP-Methode eindeutig vorteilhafter, da hierbei mehr Zellen nach dem ballistischen Gentransfer für die magnetische Separation zur Verfügung stehen und die magnetische Anreicherung effizienter ist. Mit einer Computersimulation wurden die optimalen Bedingungen für den ballistischen Gentransfer ermittelt. Aufgrund der erhaltenen Daten konnten konkrete Vorschläge für eine praktische Umsetzung im Labor gemacht werden. Diese Erkenntnisse können direkt genutzt werden, um die Herstellung von Gentherapeutischen Vakzinen für zukünftige Studien und klinische Anwendungen noch effektiver zu gestalten.

The weak point of all gene therapy projects is still the gene transfer procedure. For clinical applications, a transfection method would be optimal, by which with small expenditure and without safety risk, an efficient transfection of only the desired cell type, in sufficient number, could be achieved. The cells should be changed exclusively in the necessary way, without modifying other characteristics. The method of the ballistomagnetic gene transfer represents a beginning for the solution of this problem (134). It is limited however by the fact that only adherent cells can be effectively transfected. Thus, before transfection, an adherent cell culture must be made from a patients? tumor cells. For our gene therapy studies at Centrum Somatische Gentherapie, Berlin, this represents a considerable restriction, since it comes with the cultivation of the cells won from tumor material to a selection of the adherent cell clones and therefore all nonadherent tumor cells are removed from the culture. Thereby the tumor cell pool, of which the vaccine is subsequently made, is limited. In addition, the portion of the fast-growing tumor cells overgrow with increased cultivation duration, the slowly growing cells in the culture. At the time of transfection the tumor cells used for the production of the vaccine thus only partly represent the original tumor, from which they were won. The long-term cultivation of the tumor cells is limited to approximately 30% of the operated patients tumor cells, since only this portion of tumor derived cells can be kept successfully in culture. In my study, the ballistomagnetic gene transfer was modified for application in clinical gene therapy studies. The work routine was optimized and its effectiveness was increased. In order to be able to transfect cells, independently of their adherence characteristics, the cells are now briefly plated in a monolayer on mircoporous polycarbonate supports. This method is called in the following MIP-method (microporous polycarbonate membrane method). By combination of the ballistomagnetic gene transfer with the MIP- method, it is now possible to transfect directly the autologous won tumor cells of all patients without previous cultivation. This permits the production of therapeutic vaccines from tumor cells with immunologically unchanged cell surface and thereby increased probability, that the structures relevant for the immunisation e.g. tumor antigens are presented to the immune system of the patient. On average 89% of the used cell lines could be recovered after ballistic gene transfer if the MIP-Method was used. With application of the comparison method developed by Burkholder et al. (123) 58% of the cells could be recovered. Also the magnetic separation was more efficient, if the cells were plated before with the MIP method. Thus one received on average 1.7 times more cells over the used cell lines after ballistic gene transfer and altogether 3.7 times more cells after magnetic separation than with the comparison method. The relative number of transfected cells as determined by flow cytometric evaluation, did not differ significantly for both methods. If one regards however the absolute number of the transfected cells, then the application of the MIP method is clearly more favourable, since here after the ballistic gene transfer more cells are at disposal for the magnetic separation. Moreover the magnetic enrichment by itself is more efficient. With a computer simulation, the optimal conditions for the ballistic gene transfer were determined. With the received data, concrete suggestions for a practical application in the laboratory could be made. These realizations can be used directly to further optimize the production of gene-therapeutic vaccines for future studies and clinical applications.