Establishment of in vitro cultures of porcine reproductive epithelia \- oviduct and cervix uteri –

Abstract

The molecular pathways in the morphologically and functionally different tissue of the reproductive tract of mammals are still incompletely elucidated. For exploring the processes leading to successful reproduction, differentiated in vitro systems modelling the mammalian reproductive tract are needed. The pig serves as a valuable resource for adequate material for several reasons. Since anatomy of the organs, as well as physiological and pathophysiological responses have been found to be very similar to those in humans, the pig is a more valid model for human research than rodent species and, therefore, an important alternative as a non-rodent animal species. This is especially true for the early processes in reproduction. Furthermore, due to the industrial porc production, porcine material for cell culture is easily available (slaughterhouse). Biological variations between the different individuals concerning age, cycle stage (mostly pre-pubertal animals) and breed (hybrids of German Edelschwein, German Landrace and Pietrain) are reduced. This leads to a low biological variation. In the present studies, culture conditions for primary porcine epithelial cells derived from the oviduct and the cervix uteri were optimized with regard to morphological differentiation and usability for extended cultivation periods. To evaluate different growth media for the primary cells, we used morphological criteria as well as realtime impedance measurement. After an initial media testing, the cells were grown on hanging membranes and the culture settings (conventionally cultured, serum gradient over the membrane (for the oviductal cell culture only) and air-liquid interface) were assessed by histology and electron microscopy (only oviductal cells). For the oviductal cell culture, we proved long-term expression of an oviduct specific marker (oviductal glycoprotein 1) and showed a speci_c hormone responsiveness of the culture system by means of quantitative reverse transcription PCR (qPCR). Dfferentiated epithelial cells could reproducibly be cultured up to six weeks in an air-liquid interface. After three weeks of culturing, the cells were clearly polarized and exhibited motile cilia. The model maintains physiological properties such as morphological features (mixed cell population of ciliated and secretory cells, apical cell-cell contacts typical for columnar epithelial cells) and oviduct-specific markers showing hormone responsiveness. We could reproducibly culture pure epithelial cells out-growing from fresh tissue explants of the porcine cervix uteri. The optimised growth medium was conditioned Ham's F-12, containing 10 % FCS1, EGF2 and insulin. When growing cells in an air-liquid interface for three weeks, the cells showed a multilayered phenotype. The cells were of epithelial origin and showed beta catenin expression as well as production of mucopolysaccharides. Finally, polarized in vitro-systems of the porcine cervical and oviductal epithelium preserving detailed features of the native tissue were successfully established. Especially the oviductal cell culture model is very promising and will further promote subsequent research projects.

Die molekularen Vorgänge innerhalb der morphologisch und funktionell sehr unterschiedlichen Gewebe des weiblichen Reproduktionstraktes des Säugetieres sind bisher nicht komplett aufgeklärt. In vitro-Systeme, die die physiologischen und pathophysiologischen Gegebenheiten widerspiegeln, sind notwendig, um die Prozesse zu verstehen, die zu einer erfolgreichen Reproduktion führen. Als Ressource für adäquates Zellmaterial bietet sich das Schwein aus mehreren Gründen an. Es ist eines der favorisierten Modelle für den menschlichen Organismus, da das Schwein dem Menschen, im Vergleich zu den für in vivo-Versuche häufig eingesetzten Nagetieren, unter vielen anatomischen und physiologischen Gesichtspunkten ähnlicher ist. Dies trifft insbesondere auf die frühen Prozesse des Reproduktionsgeschehens zu. Zudem ist Gewebe aus dem porcinen Reproduktionstrakt als Nebenprodukte der Fleischproduktion (Schlachthof) leicht verfügbar. Darüber hinaus zeigen die Donor-Tiere bedingt durch die industrialisierte Schweinezucht wenig individuelle Unterschiede betreffend z.B. des Zyklusstandes (präpubertäre Tiere) und der Rasse (fast ausschließlich Hybride aus Deutschem Edelschwein, Landrasse und Pietrain). Dies reduziert die biologische Schwankungsbreite entsprechend. In der vorliegenden Doktorarbeit wurden Isolierungsmethoden und Kulturbedingungen für Epithelzellen aus Eileiter und Gebärmutterhals unter dem Gesichtspunkt der morphologischen Differenzierung und einer möglichen Langzeitkultivierung untersucht und optimiert. Um die verschiedenen Wachstumsbedingungen der Epithelzellkulturen zu bewerten wurden sowohl morphologische Kriterien als auch Echtzeit Impedanzmessungen herangezogen. Nach einer anfänglichen Untersuchung von Wachstumsmedien wurden die Epithelzellen unter unterschiedlichen Kulturbedingungen auf hängenden, permeablen Membranen kultiviert. Die Zellkulturen der einzelnen Kulturbedingungen (konventionell, mit einem Serumgradienten über die Membran (nur für die Eileiterzellkultur) oder in einem Air-Liquid-Interface mit Kontakt zum Medium ausschließlich von der basolateralen Zellseite) wurden histologisch und elektronenmikroskopisch (nur Eileiterzellkultur) ausgewertet. Rein epitheliale Zellen aus dem Gebärmutterhals konnten über ein Auswachsen aus Gewebeexplantaten gewonnen werden. Als optimiertes Wachstumsmedium diente konditioniertes Ham's F-12, mit 10 % FCS, EGF und Insulin. Eine dreiwöchige Kultur der Zellen im Air-Liquid- Interface führte zum Wachstum eines mehrschichtigen Cervixepithels. Hier konnten sowohl beta-Catenin als Differenzierungsmarker sowie eine Mukusproduktion nachgewiesen werden. Differenzierte Epithelzellen des Eileiters in ihrer natürlichen Zusammensetzung (Zilien tragende und sekretorische Zellen) konnten reproduzierbar über sechs Wochen im Air-Liquid- Interface gehalten werden. Schon nach einer Kulturdauer von drei Wochen polarisierten die Zellen deutlich und zeigten motile Kinozilien. Die Expression eines Eileiter-spezifischen Markers (oviductal glycoprotein 1) wurde nachgewiesen und eine spezifische Antwort auf Hormonstimulation konnte mittels quantitativer Polymerasekettenreaktion (qPCR) gezeigt werden. In den hier etablierten in vitro-Systemen der Epithelien von Eileiter und Gebärmutterhals konnten mit denen im natürlichem Gewebe vergleichbare Verhältnisse erhalten beziehungsweise eingestellt werden. Das in der Dissertation vorgestellte Oviduktzellkultursystem lässt neue Impulse auf nachfolgende Forschungsprojekte erwarten.