Untersuchungen zur synergistischen Zytotoxizität zwischen Saponinen und Ribosomen inaktivierenden Proteinen Typ I

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurden acht Pflanzenextrakte aus Caryophyllaceae und 76 Reinsubstanzen (Saponine und Aglyka) auf ihre Zytotoxizität sowie ihr Vermögen die Zytotoxizität von Ribosomen inaktivierenden Proteinen Typ I (RIP I) synergistisch zu verstärken, untersucht. Dazu wurde ein zellbasiertes Model mit ECV-304-Zellen und dem natürlicherweise wenig zytotoxischen RIP-I Saporin als Standard-RIP-I entwickelt. Für die untersuchten Substanzen ließen sich Struktur-Wirkungs-Beziehungen aufstellen. Daraus konnten essentielle Strukturmerkmale, welche eine synergistische Zytotoxizitätsverstärkung von RIP I ermöglichen, identifiziert werden. Es konnten dabei auch Strukturmerkmale identifiziert werden, welche eine synergistische Zytotoxizitätsverstärkung von RIP I stören oder verhindern. Die Isolation der zwei potenten, in Kombination mit RIP I synergistisch zytotoxischen Saponine SA1641 und SA1657 gelang aus Saponinum album, einem ehemals kommerziellen Saponingemisch der Firma Merck. SA1657 konnte dabei als neue Verbindung identifiziert werden. Aus einem Extrakt von Samen von Agrostemma githago L. gelang die Isolation von vier Saponinen. Drei dieser Verbindungen konnten als Gypsophilasaponin 1 – 3 identifiziert werden, welche für diese Stammpflanze bisher noch nicht beschrieben waren. Die Verbindung Agrostemmasaponin 3 stellte sich als neu heraus und konnte im untersuchten Konzentrationsbereich die Zytotoxizität von RIP I synergistisch verstärken. Eine erwartete Verstärkung der synergistischen Zytotoxizitätsverstärkung durch die Kombination von Saponinen aus Agrostemma githago L. mit dem ebenfalls aus dieser Pflanzen stammenden RIP I Agrostin gegenüber der Kombination mit dem ansonsten in der Arbeit verwendeten RIP I Saporin aus Saponaria officinalis L. konnte nicht festgestellt werden. In Untersuchungen zur Membranaktivität von Saponinen konnte eine lineare Korrelation zwischen der Membrantoxizität von Saponinen und deren Vermögen die Oberflächenspannung wässriger Lösungen zu verringern aufgezeigt werden. Weiterhin wurde ein zellbasiertes Membranmodell entwickelt, mit dem unter Verwendung von radioaktiv markiertem Cholesterol der Einfluss von Saponinen auf den Cholesterolgehalt von Membranen untersucht werden konnte. Es konnte gezeigt werden, dass membranaktive Saponine den Cholesterolgehalt von Zellmembranen konzentrationsabhängig senken können. In diesem Zusammenhang konnte auch gezeigt werden, dass diese Saponine ebenfalls die Aufnahme freien Cholesterols in die Zellmembran behindern können. Nicht membranaktive Saponine zeigten im gleichen Konzentrationsbereich keinen signifikanten Einfluss auf den Cholesterolgehalt. Ein Einfluss des membranaktiven und in Kombination mit RIP I synergistisch zytotoxizitätsverstärkenden Saponins SA1641 auf den Cholesterolgehalt von Endosomen konnte nicht nachgewiesen werden.

In the present work eight plant extracts of Caryophyllaceae and 76 substances (saponins and aglyca) were analyzed for their cytotoxicity and their ability to synergistically enhance the cytotoxicity of ribosome-inactivating proteins type I (RIP I). Therefore a cell-based model using ECV-304-cells and the naturally little cytotoxic RIP-I saporin, considered as a standard-RIP-I, was developed. Referring these results to the structures of the substances, structure-activity-relationships (SAR) were established. This allowed identifying structural features that enable and amplify the cytotoxicity of RIP I. It also allowed detecting structural features that inhibit the synergistic enhancement of cytotoxicity of RIP I. Two potent saponins, SA1641 and SA1657, which synergistically enhance the cytotoxicity of RIP I were isolated from Saponinum album, a formerly commercial saponin mixture of the company Merck. The structure of SA1657 was elucidated as new substance. Four saponins were isolated from an extract from the seeds of Agrostemma githago L. Although three of these substances, Gypsophilasaponin 1 – 3, were already known from other species, they were described for this species for the first time. The structure of Agrostemmasaponin 3 was elucidated as new substance and synergistically enhanced the cytotoxicity of RIP I. A further amplification of the synergistic enhancement of the cytotoxicity of the RIP I Agrostin that is also present in the species, compared to the synergistic enhancement of the cytotoxicity of the RIP I Saporin from Saponaria officinalis L. by the saponins isolated from Agrostemma githago L. was not detected. Experiments on the membrane activity of saponins revealed a linear correlation between the membrane toxicity of saponins and their characteristic to lower the surface tension of aqueous solutions. Furthermore a cell-based model using radiolabeled cholesterol was developed to analyze the influence of saponins on the cholesterol content of cell membranes. Results from the model showed, that membrane active saponins lowered the cholesterol content of cell membranes. These saponins also hindered the uptake of free cholesterol into the cell membrane resulting in a decreased cholesterol content compared to a control. Saponins that are not membrane active did not influence the cholesterol content of cells in the same range of concentration. An influence of the membrane active saponin SA1641 on the cholesterol content of endosomes was not detectable.